Enzyme Immunoassay Reagent Kit

1

Kit de r�actifs pour dosage immunoenzymatique

Enzym-Immunoassay Reagenzien-Kit

2

Kit di Reagenti per Saggio Immunoenzimatico

Enzyme Immunoassay Reagent Kit

The activation of leukocytes prompts the secretion of MPO and the generation of oxidants.1 Several lines of evidence suggest that the enzyme myeloperoxidase (MPO), secreted by the leukocytes, participates in atherosclerotic progression and contributes to plaque vulnerability.2,3 MPO has been linked to the development of lipid-laden soft plaque, the activation of protease cascades affecting the stability and thrombogenicity of plaque, the production of cytotoxic and prothrombogenic oxidized lipids, and the consumption of nitric oxide, leading to vasoconstriction.3

The plasma MPO concentration in patient samples acquired during the period of assessment for acute coronary syndrome in the Emergency Department predicts the risk of major adverse cardiac events (MACE); i.e. myocardial infarction, need for revascularization or death, over the next 30-day and 6-month interval.2 The odds ratio for MACE increases with increasing levels of plasma MPO in all quartiles of the population. The predictive power of the MPO concentration is independent of age, gender, race, CRP level, Troponin T level, CK-MB level, history of diabetes, history of smoking, history of hyperlipidemia, and history of hypertension.

4

Calibrators are added directly to the appropriate wells of the Microtiter Plate. Assay Buffer is added to all wells that are intended for Control or sample analysis. Aliquots of Controls or samples are added to the appropriate wells and the plate is incubated for 45 minutes at 20-26�C. The wells are then washed with Wash Buffer to remove antigens not specifically bound to the immobilized antibody.

An anti-MPO monoclonal antibody labeled with the enzyme horseradish peroxidase (HRP) is then added to each well and incubated for 45 minutes at 20-26�C. This conjugated antibody binds to the MPO captured on the plate, and the MPO in the sample is �sandwiched� between the antibody on the solid phase and the antibody conjugate. The plate is again washed with Wash Buffer to remove unbound HRP-labeled antibody.

The substrate, tetramethylbenzidine (TMB), is then added to each well and incubated for 15 minutes at 20-26�C resulting in the development of a blue color. Color development is stopped with the addition of Stop Solution, changing the color to yellow.

The enzymatic turnover of the substrate is determined spectrophotometrically at 450 nm, preferably with correction at 630 nm, and is directly proportional to the concentration of MPO. The absorbances of the Calibrators are used to plot a calibration curve of absorbance versus MPO concentration from which the MPO concentration in the Controls or samples can be determined.

Microtiter plate coated with a mouse monoclonal antibody specific to MPO, 12x8-well strips.

Citrate buffered saline containing detergents and additives.

Yellow solution of a mouse monoclonal antibody specific to MPO conjugated to HRP.

Solution of sulfuric acid (0.4N) in water. Keep tightly capped.

Tris-buffered saline containing detergents.

5

6

Unopened test kits should be stored refrigerated (2-8 �C) upon receipt and until the expiration date. Unused microtiter stripwells should be stored sealed in the foil pouch with desiccant at 2-8 �C. When stored as directed, unopened test kits will remain stable until the expiration date indicated on the label. Do not use any reagents that show indications of discoloration, cloudiness, precipitation, or leakage.

Procedural Notes

1. Allow reagents, samples, Calibrators and Controls to warm to room temperature (20�26�C) for at least 30 minutes before use.

2. Vortex the samples, Calibrators, and Controls to mix thoroughly. Avoid foaming.

3. Remove the stripwell frame and required number of coated microtiter strips from the foil pouch after bringing the plate to room temperature (20�26�C). Place any unused stripwells in the foil pouch with the enclosed desiccant, reseal, and store at 2-8�C.

4. Use a new polypropylene pipette tip for each reagent, Calibrator, Control, or sample to prevent contamination.

5. All Calibrators, Controls, and samples should be run in duplicate.

6. Prior to the addition of Anti-MPO Antibody Conjugate and TMB Substrate Reagent, ensure that there is no residual Wash Buffer in the wells. Any remaining Wash Buffer may cause variation in test results.

7

7. For accurate measurement, the addition of samples, Calibrators, and Controls must be precise. Pipet carefully using only calibrated equipment.

8. All kit components, except Wash Buffer Concentrate, are supplied ready to use. Refer to the following procedure for preparing Working Wash Buffer solution.

1X Working Wash Buffer Preparation

Allow Wash Buffer Concentrate to come to room temperature (20�26�C) prior to use. Prepare 1X Working Wash Buffer by pouring a bottle of the provided 25X Wash Buffer Concentrate into a clean one liter vessel. Rinse the bottle with Type I deionized water to remove residual buffer and dissolve crystals. Add the rinse, dilute with Type I deionized water to a total volume of 1.0 liter and mix thoroughly. When stored at 2-8�C, 1X Working Wash Buffer is stable for up to two months.

Plate Preparation

Sample Incubation

3. Blot the plate on absorbent paper towels after the final wash to remove any remaining Wash Buffer. Do not allow wells to dry. Proceed immediately to next step.

Antibody Conjugate Incubation

4. Blot the plate on absorbent paper towels after the final wash to remove any remaining Wash Buffer. Do not allow wells to dry. Proceed immediately to next step.

8

Substrate Incubation and Color Development

Stop and Reading

2. Gently swirl the plate on a flat surface to mix. Ensure that the blue color has completely changed to yellow.

3. Read the optical density at 450 nm using a microtiter plate reader. Background correction at 630 nm is recommended.

1. Construct a calibration curve using appropriate computer software. A four-parameter curve fit is recommended. Manual calculations can be performed by plotting the mean absorbance obtained for each Calibrator on the y-axis versus the MPO concentration (pmol/L) on the x-axis.

2. Using the mean absorbance value for each sample and Control, determine the corresponding concentration of MPO in pmol/L from the calibration curve. The MPO level assigned for each Calibrator reflects the use of the 10 μL sample size (a 1:10 dilution in the plate) so no further calculation is required.

3. Samples with MPO levels exceeding the value of the highest Calibrator may be reported as greater than that level, e.g. > 8000 pmol/L. Further dilution of samples is not recommended.

9

Results of a typical calibration curve using O.D. readings at 450 nm with correction at 630 nm are shown on the y-axis against MPO concentrations (pmol/L) shown on the x-axis. The user should generate a new calibration curve with each test performed. The following calibration curve is for illustration purposes only.

A

8020

2.630

B

3650

2.000

C

1580

1.108

D

490

0.346

E

0

10

Procedure

Clinical Interpretation

The median MPO level for subjects in the adjusted database was 340 pmol/L and the range of results was 137 to 984 pmol/L. The non-parametric distribution of myeloperoxidase levels in this normal population yields a two-tailed central 95% reference interval, corrected for the influence of outlier rejection, of 156 � 734 pmol/L. However, in this application the more appropriate single-tailed lower 95% reference interval, again corrected for the influence of the outlier rejection method, is < 640 pmol/L.

Sensitivity

The minimum detection limit, as calculated by interpolation of the mean plus two standard deviations of 26 replicates of the 0 pmol/L MPO Calibrator (E), is 14 pmol/L MPO.

11

Assay Precision

Total and within-run precision were determined by testing 6 Lithium Heparin Plasma Test Samples with MPO concentrations distributed throughout the calibration range of the assay, according to CLSI (formerly NCCLS) guideline EP5-A. These samples were assayed in duplicate, using a single lot of reagents and Calibrators, on two separate plates per day, for twenty days. A new calibration curve was run in duplicate on each plate. The results of the precision study are summarized in the following table.

Lithium heparin plasma Sample 1

307

80

10.2%

5.8%

Lithium heparin plasma Sample 2

610

80

5.8%

5.0%

Lithium heparin plasma Sample 3

1285

76*

7.4%

5.7%

Lithium heparin plasma Sample 4

1459

80

8.9%

8.6%

Lithium heparin plasma Sample 5

2745

80

9.0%

9.0%

Lithium heparin plasma Sample 6

4758

80

8.7%

6.4%

Average

8.3%

6.7%

* 1 days worth of data was excluded from analysis due to gross outliers

Linearity

Spiking recovery

Nine lithium heparin plasma samples were spiked with 497, 1456, and 2851 pmol/L MPO and analyzed for recovery. The percent recovery was calculated by dividing the mean measured MPO concentration of the spiked sample by the expected MPO concentration, where the expected MPO concentration was the sum of the measured MPO concentration in the neat plasma sample and the concentration of the MPO spike. The average recovery of spiked MPO in lithium heparin plasma ranged from 87% to 117% with a mean of 100.7%.

12

Dilution recovery

Nine lithium heparin plasma samples were spiked with 2851 pmol/L MPO and diluted 1:2, 1:4, and 1:8 with Assay Buffer. The percent recovery was calculated by dividing the mean MPO concentration of the pre-diluted sample multiplied by the dilution factor by the mean MPO concentration of the sample with no pre-dilution. The mean recovery of a 1:2 dilution was 113% for lithium heparin plasma, with recoveries ranging from 107% to 117%

Cross-reactivity

The potential cross-reactants shown in the following table were tested in lithium heparin plasma and Assay Buffer, according to NCCLS guideline EP7-A. All investigated proteins exhibited less than 0.007% cross-reactivity at the high test concentration and less than 1.7% cross-reactivity at the low test concentration when added to a lithium heparin plasma pool.

Substance tested

Concentrations tested (nmol/L)

1250, 125, 12.5

C-reactive protein, human

543, 54.3, 5.43

Lysozyme, human

4464, 446.4, 44.64

IgA, human

417, 41.7, 4.17

Elastase, human

2500, 250, 25

Eosinophil Peroxidase, human

887, 88.7, 8.87

Lactoperoxidase, bovine

801, 80.1, 8.01

Lactoferrin, human

781, 78.1, 7.81

COX1, ovine

893, 89.3, 8.93

COX2, human

868, 86.8, 8.68

Thyroid peroxidase, human

595, 59.5, 5.95

Troponin I, human

2155, 215.5, 21.55

13

Interfering Substances

The substances shown in the following table, when tested in plasma containing 3000 pmol/L and 1000 pmol/L MPO according to NCCLS guideline EP7-A, were found not to interfere up to the concentrations indicated. Bias of 10% or less was not considered interference.

Acetylsalicylic acid

600

Toxic dose

Albumin

50000

High*

Amoxicillin

75

3x therapeutic dose

Bilirubin, conjugated

50

High*

Bilirubin, unconjugated

150

High*

Captopril

5

Toxic dose

Ceruloplamin

600

High

Cholesterol

1000

High*

DNA

16.7

High

Fenofibrate

45

3x therapeutic dose

Hemoglobin

5000

Hemolysis*

Heparin, lithium

3000 U/L

3x therapeutic dose

Hydrochlorothiazide

6

3x therapeutic dose

Hydrocortisone

0.69

Toxic dose

Ibuprofen

500

Toxic dose

Indomethacin

36

2x therapeutic dose

Isosorbide dinitrate

0.15

3x therapeutic dose

Lovastatin

53

2x therapeutic dose

Methotrexate

160

Therapeutic dose

Metoprolol

5

Toxic dose

Naproxen

500

4x therapeutic dose

Niacin

0.5

5x therapeutic dose

Nifedipine

0.4

2x therapeutic dose

Salicylic acid

600

Toxic dose

Sodium azide

0.50%

5x preservative dose

Triglycerides

5000

Lipemia

* High level of interfering substance per NCCLS EP7-A

Hook

14

Interfering Antibodies

Multivariate logistic-regression models (SAS version 8.0, SAS Institute) were developed to calculate odds ratios and 95% confidence intervals. The adjusted covariates were age, gender, race, Troponin T (≤0.03 ng/mL vs. >0.03 ng/mL)7, C-reactive Protein (<1 mg/L, 1-3 mg/L, >3 mg/L)2, CK-MB (≤8.8 ng/mL vs. >8.8 ng/mL)7, history of smoking, history of diabetes, history of hypertension, and history of high cholesterol. Missing covariate information on some subjects reduced the study population. The risk of MACE in all patients in the ensuing 30-day period increased with increasing quartiles of myeloperoxidase levels.

Similar analysis of patients that were persistently negative for Troponin T (≤0.03 ng/mL) also revealed a significantly higher risk of MACE for patients with plasma MPO levels in higher quartiles. Adjusted odds ratios and the percentage of patients within an MPO quartile with and without MACE at 30 days are shown in the following graphs and tables.

15

1.0

2.5

2.8

3.3

NA

1.3-4.8

1.5-5.6

1.7- 6.4

p = 0.007

p = 0.0021

p < 0.001

*In each analysis the first quartile served as the reference group

1.0

3.4

4.1

6.9

NA

1.2-9.4

1.5-11.4

2.5-19.2

p = 0.0194

p =0.007

p < 0.001

*In each analysis the first quartile served as the reference group

It should be noted that different cut-off points may be appropriate for different clinical populations.

16

1. Klebanoff SJ, et al. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brennan ML, et al. N Engl J Med 2003; 349: 1595-604.

3. Hazen, SL. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004: 24(7): 1143-1146.

4. Engvall E, Perlman P. Immunochemistry, 1971 8(9): 871-874.

5. CLSI (formerly NCCLS). CLSI Document H18-A2 1999 CLSI Wayne, PA.

6. Horn, et al. Clinical Chemistry 2001; 47/12: 2137-2145.

7. McErlean, ES, et al. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

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Enzyme Immunoassay Reagent Kit

1. Allow all reagents, Calibrators, Controls, and patient samples to warm to room temperature (20-26�C) for at least 30 minutes prior to use.

2. Vortex Calibrators, Controls, and samples to mix thoroughly.

4. Pipet 90 μL of Assay Buffer into all sample and Control microtiter wells.

6. Seal and incubate for 45 minutes, rotating at 500 rpm.

7. Wash 4 times with 400 μL Working Wash Buffer and blot to remove excess buffer.

8. Add 100 μL Anti-MPO Antibody Conjugate (yellow) to each well.

9. Seal and incubate 45 minutes, rotating at 500 rpm.

10. Wash 4 times with 400 μL Working Wash Buffer and blot to remove excess buffer.

11. Add 100 μL TMB Substrate Reagent to each well.

12. Incubate 15 minutes, rotating at 500 rpm.

13. Add 100 μL Stop Solution to each well and swirl to mix.

14. Read the absorbance at 450 nm, preferably with correction at 630 nm.

Calibrators and Controls may need to be positioned differently based on the number of samples assayed.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

CAL A

2

6

9

13

17

20

24

28

CTL3

35

39

B

CAL B

3

7

10

14

18

21

25

29

CTL3

36

40

C

CAL C

3

CTL1

10

14

18

21

25

29

32

36

40

D

CAL D

4

CTL1

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL A

E

CAL E

4

7

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL B

F

1

5

8

12

16

20

23

27

31

34

38

CAL C

G

1

5

8

12

16

CTL2

23

27

31

34

38

CAL D

H

2

6

9

13

17

CTL2

24

28

32

35

39

CAL E

18

La activaci�n de los leucocitos induce la secreci�n de mieloperoxidasa y la generaci�n de oxidantes.1 Varias l�neas de pruebas cl�nicas sugieren que la enzima mieloperoxidasa (MPO), secretada por los leucocitos, participa en la progresi�n ateroscler�tica y contribuye a la vulnerabilidad de las placas.2,3 Se ha vinculado la MPO con la aparici�n de placas blandas cargadas de l�pidos, la activaci�n de cascadas de proteasas que afectan a la estabilidad y la trombogenia de la placa, la producci�n de l�pidos oxidados citot�xicos y protromb�genos, y el consumo de �xido n�trico, que lleva a la vasoconstricci�n.3

La concentraci�n plasm�tica de MPO en las muestras de pacientes adquiridas en el per�odo de evaluaci�n de un s�ndrome coronario agudo en el servicio de urgencias predice el riesgo de episodios card�acos adversos mayores (ECAM), es decir, infarto de miocardio, necesidad de revascularizaci�n o muerte, en el siguiente intervalo de 30 d�as y de seis meses.2 La raz�n de posibilidades de las ECAM aumenta al aumentar las concentraciones plasm�ticas de mieloperoxidasa en todos los cuartiles de la poblaci�n. El poder predictivo de la concentraci�n de MPO depende de la edad, el sexo, la raza, la concentraci�n de CRP, la concentraci�n de troponina T, la concentraci�n de CK-MB, y los antecedentes de diabetes, tabaquismo, hiperlipidemia e hipertensi�n.

19

Los calibradores se a�aden directamente a los pocillos correctos de la microplaca de titulaci�n. La soluci�n amortiguadora del an�lisis se a�ade a todos los pocillos indicados para el an�lisis de los controles o de la muestra. Se a�aden al�cuotas de control o muestra a los pocillos correspondientes y la placa se incuba durante 45 minutos a una temperatura de 20 a 26 �C. A continuaci�n, los pocillos se lavan con soluci�n amortiguadora de lavado, para eliminar los ant�genos que no se hayan unido espec�ficamente al anticuerpo inmovilizado.

Luego, se a�ade a cada pocillo anticuerpo monoclonal anti-MPO, marcado con la enzima peroxidasa de r�bano picante (HRP) y se incuba durante 45 minutos a una temperatura de 20 a 26 �C. Este anticuerpo conjugado se fija a la MPO capturada en la placa, y se forma un "s�ndwich" con la MPO presente en la muestra, entre el anticuerpo de la fase s�lida y el conjugado de anticuerpo. La placa se vuelve a lavar con soluci�n amortiguadora de lavado para eliminar el anticuerpo marcado con HRP que se haya unido.

Seguidamente, se a�ade a cada pocillo el sustrato, tetrametilbenzidina (TMB), y se incuba durante 15 minutos a 20 a 26 �C, lo que causa el revelado de un color azul. El revelado del color se detiene con la adici�n de la soluci�n de parada, que cambia el color a amarillo.

El recambio enzim�tico del sustrato se determina mediante espectrofotometr�a a 450 nm, preferiblemente con correcci�n a 630 nm, y es directamente proporcional a la concentraci�n de MPO. Las absorbancias de los calibradores se emplean para trazar una curva de calibraci�n de absorbancia frente a concentraci�n de MPO, desde la cual se puede determinar la concentraci�n de MPO en los controles o en las muestras.

Microplaca de titulaci�n recubierta con anticuerpo monoclonal espec�fico de la MPO, 12 tiras de 8 pocillos cada una.

Soluci�n salina amortiguada con citrato, que contiene detergentes y aditivos.

Soluci�n amarilla de un anticuerpo monoclonal espec�fico de la MPO, conjugado con HRP.

20

Soluci�n salina amortiguada con Tris, que contiene detergentes.

21

Los equipos de prueba sin abrir deber�n mantenerse refrigerados (2 a 8 �C) a su llegada y hasta la fecha de caducidad. Las tiras de pocillos de las microplacas sin usar deber�n guardarse selladas en la bolsa de aluminio, con desecante, a una temperatura de 2 a 8 �C. Si los equipos de an�lisis sin abrir se almacenan seg�n las instrucciones, permanecer�n estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. No usar ning�n reactivo que muestre signos de decoloraci�n, turbidez, precipitaci�n o derrame.

Notas sobre el procedimiento

1. Dejar que los reactivos, las muestras, los calibradores y los controles se calienten a temperatura ambiente (de 20 a 26 �C) durante 30 minutos por lo menos, antes de su uso.

2. Agitar las muestras, los calibradores y los controles en v�rtice, para que se mezclen bien. Ev�tese la formaci�n de espuma.

3. Retirar de la bolsa de aluminio el marco de las tiras de pocillos y el n�mero necesario de tiras de microtitulaci�n recubiertas, despu�s de llevar la placa a temperatura ambiente (de 20 a 26 �C). Colocar las tiras de pocillos sin usar en la bolsa de aluminio, con el desecante; volver a cerrar herm�ticamente conservar a una temperatura de 2 a 8 �C.

4. Usar una punta de polipropileno nueva para cada reactivo, calibrador, control o muestra, para evitar la contaminaci�n.

5. Todos los calibradores, controles y muestras deber�n analizarse por duplicado.

6. Antes de a�adir el conjugado de anticuerpo anti-MPO y el reactivo de sustrato de TMB, asegurarse de que no queden restos de soluci�n amortiguadora de lavado en los pocillos. Los restos de soluci�n amortiguadora de lavado pueden producir una variaci�n de los resultados de la prueba.

7. Para una determinaci�n exacta, la adici�n de muestras, calibradores y controles debe ser precisa. Pipetear con cuidado, usando exclusivamente un equipo calibrado.

8. Todos los componentes del equipo, salvo el concentrado de soluci�n amortiguadora de lavado, se entregan listos para usar. Consultar el siguiente procedimiento para la preparaci�n de la soluci�n amortiguadora de lavado.

Preparaci�n de la soluci�n amortiguadora de lavado de trabajo 1X

Antes de usar, dejar que el concentrado de soluci�n amortiguadora de lavado alcance la temperatura ambiente (de 20 a 26 �C). Preparar soluci�n amortiguadora de lavado de trabajo 1X vertiendo un frasco del concentrado de soluci�n amortiguadora de lavado 25X en un recipiente limpio de un litro. Aclarar el frasco con agua desionizada tipo I para eliminar los restos de soluci�n amortiguadora y disolver los cristales. A�adir el aclarado, diluir con agua desionizada tipo I hasta un volumen total de 1,0 litros y mezclar bien. Si se conserva a una temperatura de 2 a 8 �C, la soluci�n amortiguadora de lavado de trabajo 1X permanece estable hasta dos meses.

23

Preparaci�n de las placas

Incubaci�n de la muestra

3. Secar la placa en toallas de papel absorbente despu�s del lavado final para eliminar los restos de soluci�n amortiguadora de lavado. No dejar que los pocillos se sequen. Pasar inmediatamente al siguiente paso.

Incubaci�n con el conjungado de anticuerpo:

4. Secar la placa en toallas de papel absorbente despu�s del lavado final para eliminar la soluci�n amortiguadora de lavado restante. No dejar que los pocillos se sequen. Pasar inmediatamente al siguiente paso.

Incubaci�n del sustrato y revelado del color

Parada y lectura

2. Girar la placa con cuidado sobre una superficie plana para mezclar. Asegurarse de que el color azul haya cambiado completamente a amarillo.

3. Leer la densidad �ptica a 450 nm con un lector de microplacas de titulaci�n. Se recomienda una correcci�n de fondo a 630 nm.

24

1. Trazar una curva de calibraci�n usando el programa inform�tico adecuado. Se recomienda un ajuste de la curva de cuatro par�metros. Pueden hacerse c�lculos manuales mediante el trazado de la absorbancia media obtenida con cada calibrador en el eje Y, frente a la concentraci�n de MPO (pmol/l) en el eje X.

2. Con el valor de absorbancia media de cada muestra y control, determinar la concentraci�n correspondiente de MPO en pmol/l, a partir de la curva de calibraci�n. La concentraci�n de MPO asignada a cada calibrador refleja el empleo de 10 μl de muestra (una diluci�n a 1:10 en la placa), de modo que no se requieren m�s c�lculos.

3. Las muestras con concentraciones de MPO superiores al valor del calibrador m�s alto pueden notificarse como superiores a dicha concentraci�n, por ejemplo, >8000 pmol/l. No se recomienda diluir m�s las muestras.

25

Resultados de una curva de calibraci�n t�pica con las lecturas de D.O. a 450 nm, correcci�n a 630 nm, en el eje Y, frente a las concentraciones de MPO (pmol/l) en el eje X. El usuario deber� generar una nueva curva de calibraci�n con cada prueba realizada. La siguiente curva de calibraci�n se presenta s�lo con fines ilustrativos.

A

8020

2,630

B

3650

2,000

C

1580

1,108

D

490

0,346

E

0

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Procedimiento

Interpretaci�n cl�nica

La mediana de la concentraci�n de MPO en los pacientes del banco de datos ajustado fue de 340 pmol/l y los l�mites de los resultados fueron 137 y 984 pmol/l. La distribuci�n no param�trica de las concentraciones de mieloperoxidasa en esta poblaci�n normal da un intervalo de referencia del 95%, central y bilateral, con correcci�n del efecto del rechazo de los valores aberrantes, de 156 a 734 pmol/l. Sin embargo, en esta aplicaci�n, el intervalo inferior de referencia del 95%, unilateral y m�s adecuado, tambi�n con correcci�n del m�todo de rechazo de valores aberrantes, es < 640 pmol/l.

27

Sensibilidad

El l�mite m�nimo de detecci�n, calculado mediante la interpolaci�n de la media m�s dos desviaciones t�picas de 26 duplicados del calibrador de MPO a 0 pmol/l (E), es de 14 pmol/l de MPO.

Precisi�n del an�lisis

Se determin� la precisi�n total e intra-an�lisis mediante el examen de seis muestras de prueba de plasma con heparina litio con concentraciones de MPO distribuidas en todo el intervalo de calibraci�n del an�lisis, seg�n la directiva EP5-A del CLSI (antiguamente NCCLS). Estas muestras se analizaron por duplicado, con un solo lote de reactivos y calibradores, en dos placas separadas al d�a, durante 20 d�as. Se analiz� una nueva curva de calibraci�n por duplicado en cada placa. Los resultados del estudio de precisi�n se resumen en el siguiente cuadro.

Muestra 1 de plasma con heparina litio

307

80

10,2%

5,8%

Muestra 2 de plasma con heparina litio

610

80

5,8%

5,0%

Muestra 3 de plasma con heparina litio

1285

76*

7,4%

5,7%

Muestra 4 de plasma con heparina litio

1459

80

8,9%

8,6%

Muestra 5 de plasma con heparina litio

2745

80

9,0%

9,0%

Muestra 6 de plasma con heparina litio

4758

80

8,7%

6,4%

Promedio

8,3%

6,7%

* Se excluy� del an�lisis 1 d�a de datos debido a valores aberrantes grandes.

Linealidad

28

Recuperaci�n de las cantidades conocidas a�adidas

A 9 muestras de plasma con heparina litio se les a�adieron 497, 1456 y 2851 pmol/l de MPO, y se analiz� la recuperaci�n. Se calcul� el porcentaje de recuperaci�n dividiendo la concentraci�n media determinada de MPO de la muestra a la que se a�adieron cantidades conocidas por la concentraci�n esperada de MPO, donde esta concentraci�n esperada de MPO fue la suma de la concentraci�n determinada de MPO en la muestra de plasma limpio y la concentraci�n de la MPO con cantidades a�adidas. La recuperaci�n promedio de la MPO con cantidades a�adidas en el plasma con heparina litio vari� entre el 87% y el 117%, con una media del 100,7%.

Recuperaci�n de la diluci�n

A 9 muestras de plasma con heparina litio se les a�adi� 2851 pmol/l de MPO, y se diluyeron a 1:2, 1:4 y 1:8 con soluci�n amortiguadora de an�lisis. Se calcul� el porcentaje de recuperaci�n dividiendo la concentraci�n media de MPO de la muestra prediluida, multiplicada por el factor de diluci�n, por la concentraci�n media de MPO de la muestra sin prediluci�n. La recuperaci�n media de una diluci�n 1:2 fue del 113% en el caso del plasma con heparina litio;las recuperaciones variaron entre el 107% y el 117%.

29

Reactividad cruzada

Los posibles componentes con reacci�n cruzada que se muestran en el siguiente cuadro fueron examinados con plasma con heparina litio,seg�n la directiva EP7-A del CLSI (antiguamente NCCLS). Todas las prote�nas investigadas presentaron una reactividad cruzada inferior al 0,007% a la concentraci�n de an�lisis m�s alta, y una reactividad cruzada inferior al 1,7% a la concentraci�n de an�lisis m�s baja, cuando se a�adi� a un grupo de plasmas con heparina litio.

Sustancia examinada

Concentraciones examinadas (nmol/l)

1250, 125, 12,5

Prote�na C reactiva, humana

543, 54,3, 5,43

Lisozima, humana

4464, 446,4, 44,64

IgA, humana

417, 41,7, 4,17

Elastasa, humana

2500, 250, 25

Peroxidasa de eosin�filos, humana

887, 88,7, 8,87

Lactoperoxidasa, bovina

801, 80,1, 8,01

Lactoferrina, humana

781, 78,1, 7,81

COX1, ovina

893, 89,3, 8,93

COX2, humana

868, 86,8, 8,68

Peroxidasa tiroidea, humana

595, 59,5, 5,95

Troponina I, humana

2155, 215,5, 21,55

30

Sustancias interferentes

Se observ� que las sustancias presentadas en el siguiente cuadro, al ser examinadas en plasma que contiene 3000 pmol/l y 1000 pmol/l de MPO seg�n la directiva EP7-A del CLSI (antiguamente NCCLS), no interfieren hasta las concentraciones indicadas. Una desviaci�n del 10% o menos no se consider� interferencia.

�cido acetilsalic�lico

600

Dosis t�xica

Alb�mina

50000

Alta*

Amoxicilina

75

3x dosis terap�utica

Bilirrubina conjugada

50

Alta*

Bilirrubina no conjugada

150

Alta*

Captoprilo

5

Dosis t�xica

Ceruloplasmina

600

Alta

Colesterol

1000

Alta*

ADN

16,7

Alta

Fenofibrato

45

3x dosis terap�utica

Hemoglobina

5000

Hem�lisis*

Heparina litio

3000 U/l

3x dosis terap�utica

Hidroclorotiazida

6

3x dosis terap�utica

Hidrocortisona

0,69

Dosis t�xica

Ibuprofeno

500

Dosis t�xica

Indometacina

36

2x dosis terap�utica

Dinitrato de isosorbida

0,15

3x dosis terap�utica

Lovastatina

53

2x dosis terap�utica

Metotrexato

160

Dosis terap�utica

Metoprolol

5

Dosis t�xica

Naproxeno

500

4x dosis terap�utica

Niacina

0,5

5x dosis terap�utica

Nifedipina

0,4

2x dosis terap�utica

�cido salic�lico

600

Dosis t�xica

Azida s�dica

0,50%

5x dosis conservante

Triglic�ridos

5000

Lipemia

* Concentraci�n alta de sustancia interferente seg�n la directiva EP7-A del CLSI (antiguamente NCCLS).

Gancho (Hook)

31

Anticuerpos interferentes

Se elaboraron modelos de regresi�n log�stica multivariante (SAS, versi�n 8.0, SAS Institute, EE.UU.) para calcular la relaci�n de posibilidades y los intervalos de confianza del 95%. Las covariantes ajustadas fueron la edad, el sexo, la raza, la troponina T (≤0,03 ng/ml frente a >0,03 ng/ml)7, prote�na C reactiva(<1 mg/l, de 1 a 3 mg/l, >3 mg/l)2, CK-MB (≤8,8 ng/ml en comparaci�n con >8,8 ng/ml)7, los antecedentes de tabaquismo, los antecedentes de diabetes, los antecedentes de hipertensi�n y los antecedentes de colesterol elevado. La informaci�n ausente sobre covariantes en algunos pacientes redujo la poblaci�n del estudio.

El riesgo de episodios card�acos adversos mayores en todos los pacientes en los 30 d�as posteriores aument� al aumentar los cuartiles de las concentraciones de mieloperoxidasa.

Un an�lisis similar de pacientes que fueron continuamente negativos a la troponina T (≤0,03 ng/ml) tambi�n revel� un riesgo significativamente m�s alto de episodios card�acos adversos mayores en los pacientes con concentraciones de MPO en plasma en los cuartiles superiores. La raz�n de posibilidades ajustada y el porcentaje de pacientes con un cuartil de MPO con y sin episodios card�acos adversos mayores a los 30 d�as se muestran en los siguientes gr�ficos y cuadros.

32

100

90

80

70

60

ECAM

50

Sin ECAM

40

30

20

0

10

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

1,0

2,5

2,8

3,3

n.d.

de 1,3 a 4,8

de 1,5 a 5,6

de 1,7 a 6,4

p = 0,007

p = 0,0021

p < 0,001

*En cada an�lisis, el primer cuartil sirvi� como grupo de referencia.

100

90

80

70

60

ECAM

50

Sin ECAM

40

30

20

0

10

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

1,0

3,4

4,1

6,9

n.d.

1,2-9,4

1,5-11,4

2,5-19,2

p = 0,0194

p =0,007

p < 0,001

*En cada an�lisis, el primer cuartil sirvi� como grupo de referencia.

Debe se�alarse que los distintos valores discriminatorios pueden ser adecuados para poblaciones cl�nicas diferentes.

33

1. Klebanoff SJ, y cols. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brennan ML, y cols. N Engl J Med 2003; 349: 1595-604.

3. Hazen, SL. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004: 24(7): 1143-1146.

4. Engvall E, Perlman P. Immunochemistry, 1971 8(9): 871-874.

5. CLSI (antiguamente NCCLS). Document H18-A2 1999 NCCLS Wayne, PA.

6. Horn, y cols. Clinical Chemistry 2001; 47/12: 2137-2145.

7. McErlean, ES, y cols. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

Este producto est� garantizado para funcionar de la manera que se describe en el etiquetado y en la bibliograf�a de Prognostix, Inc., si se utiliza cumpliendo estrictamente las instrucciones publicadas en relaci�n con el uso de este producto. Prognostix, Inc. no ofrece ninguna otra garant�a, expl�cita o impl�cita, y SE EXIME DE RESPONSABILIDAD DE CUALQUIER GARQANT�A IMPL�CITA DE COMERCIABILIDAD O IDONEIDAD PARA UN FIN EN CONCRETO. EN NING�N CASO, PROGNOSTIX, INC. SER� RESPONSABLE DE NING�N DA�O INDIRECTO, ESPECIAL O CONSECUENCIAL.

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Este producto est� cubierto por la solicitud de patente EE.UU. 20020164662.

1. Esperar que todos los reactivos, calibradores, controles y muestras de pacientes se calienten a la temperatura ambiente (de 20 a 26 �C) durante 30 minutos como m�nimo, antes de su uso.

2. Agitar en v�rtice los calibradores, controles y muestras, para que se mezclen bien.

4. Pipetear 90 μl de soluci�n amortiguadora de an�lisis y todas las microplacas de titulaci�n de las muestras y controles.

6. Sellar e incubar durante 45 minutos, rotando a 500 r.p.m.

7. Lavar cuatro veces con 400 μl de soluci�n amortiguadora de lavado de trabajo y secar para eliminar el exceso de soluci�n amortiguadora.

8. A�adir a cada pocillo 100 μl de conjugado de anticuerpo anti-MPO (amarillo).

9. Sellar e incubar durante 45 minutos, rotando a 500 r.p.m.

10. Lavar cuatro veces con 400 μl de soluci�n amortiguadora de lavado de trabajo y secar para eliminar el exceso de soluci�n amortiguadora.

11. A�adir a cada pocillo 100 μl de reactivo de sustrato TMB.

12. Incubar durante 15 minutos, rotando a 500 r.p.m.

13. A�adir 100 μl de soluci�n de parada a cada pocillo y girar para que se mezcle.

14. Leer la absorbancia a 450 nm, preferiblemente con correcci�n a 630 nm.

Puede ser necesario colocar los calibradores y los controles en posiciones diferentes, seg�n el n�mero de muestras analizadas.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

CAL A

2

6

9

13

17

20

24

28

CTL3

35

39

B

CAL B

3

7

10

14

18

21

25

29

CTL3

36

40

C

CAL C

3

CTL1

10

14

18

21

25

29

32

36

40

D

CAL D

4

CTL1

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL A

E

CAL E

4

7

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL B

F

1

5

8

12

16

20

23

27

31

34

38

CAL C

G

1

5

8

12

16

CTL2

23

27

31

34

38

CAL D

H

2

6

9

13

17

CTL2

24

28

32

35

39

CAL E

35

Kit de r�actifs pour dosage immunoenzymatique

L�activation des leucocytes stimule la s�cr�tion de MPO et la production d�oxydants1. Plusieurs sources de donn�es indiquent que l�enzyme my�loperoxydase (MPO), s�cr�t�e par les leucocytes, participe � l��volution de l�ath�roscl�rose et favorise la fragilit� de la plaque2,3. La MPO a �t� li�e au ramollissement de la plaque lipidique, � l�activation des cascades de prot�ases affectant la stabilit� et la thrombog�n�cit� de la plaque, � la production de lipides oxyd�s cytotoxiques et prothrombog�niques, et � la consommation de monoxyde d�azote, ce qui entra�ne une vasoconstriction.3

La concentration plasmatique de MPO dans les �chantillons de patients pr�lev�s au cours de la p�riode d��valuation dans le contexte d�un syndrome coronaire aigu � l�urgence est un facteur pr�dictif du risque d��v�nements cardiaques ind�sirables majeurs (�CIM) � dont l�infarctus du myocarde, le besoin de revascularisation ou le d�c�s � au cours des 30 jours suivants et des 6 mois suivants2. Le risque relatif approch� d��CIM augmente proportionnellement aux taux plasmatiques de MPO dans tous les quartiles de la population. La valeur pr�dictive de la concentration de MPO est ind�pendante de l��ge, du sexe, de l�appartenance ethnique, du taux de CRP, du taux de troponine T, du taux de CK-MB et des ant�c�dents de diab�te, de tabagisme, d�hyperlipid�mie et d�hypertension.

36

Les calibrateurs sont ajout�s directement aux puits appropri�s de la microplaque. Le tampon de dosage est ajout� � tous les puits destin�s � l�analyse du contr�le ou de l��chantillon. Des parties aliquotes de contr�les ou d��chantillons sont ajout�es aux puits appropri�s et la plaque est incub�e pendant 45 minutes entre 20 et 26 �C. Les puits sont ensuite lav�s avec un tampon de lavage pour �liminer les antig�nes qui ne sont pas li�s sp�cifiquement � l�anticorps immobilis�.

Un anticorps monoclonal anti-MPO marqu� � la peroxydase de raifort (HRP) est alors ajout� � chaque puits et incub� pendant 45 minutes entre 20 et 26�C. L�anticorps conjugu� se lie � la MPO adsorb�e sur la plaque, puis la MPO de l��chantillon est � mise en sandwich � entre l�anticorps de la phase solide et l�anticorps conjugu�. La plaque est lav�e de nouveau avec le tampon de lavage pour �liminer les anticorps marqu�s � la HRP non li�s.

Le substrat, la t�tram�thylbenzidine (TMB), est alors ajout� � chaque puits et, pendant l�incubation de 15 minutes entre 20 et 26�C, la solution se colore en bleu. La coloration est arr�t�e par l�ajout de la solution d�arr�t, ce qui colore le tout en jaune.

La quantit� d�enzyme utilis�e par le substrat, qui est mesur�e spectrophotom�triquement � 450 nm, pr�f�rablement avec une correction de 630 nm, est directement proportionnelle � la concentration de MPO. Les absorbances des calibrateurs sont utilis�es pour tracer une courbe d��talonnage de l�absorbance par rapport � la concentration de MPO, laquelle permet de d�terminer la concentration de MPO dans les contr�les ou les �chantillons.

Mat�riel fourni avec le kit:

Microplaque enduite d�anticorps monoclonaux murins anti-MPO, 12 rang�es de 8 puits

Solution saline tamponn�e au citrate contenant des d�tergents et des additifs.

Solution jaune d�anticorps monoclonaux murins anti-MPO conjugu�s � l�HRP.

Solution aqueuse d�acide sulfurique (0,4 N) Tenir bien ferm�e.

Solution saline tamponn�e au Tris contenant des d�tergents.

MPO en tampon de phosphate avec prot�ines, d�tergents et stabilisateurs. Pour conna�tre les concentrations r�elles, voir les �tiquettes de chaque calibrateur.

38

Les kits de tests non ouverts doivent �tre r�frig�r�s (entre 2 et 8 �C) d�s leur r�ception et jusqu�� leur date de p�remption. Les bandes de puits de microtitrage non utilis�es doivent �tre conserv�es scell�es dans un sachet en pellicule d�aluminium, avec un produit d�shydratant, entre 2 et 8 �C. Les kits de tests non ouverts, stock�s comme indiqu�, restent stables jusqu�� la date de p�remption figurant sur l��tiquette. Les r�actifs pr�sentant des signes de d�coloration, de turbidit�, de pr�cipit� ou de fuite ne doivent pas �tre utilis�s.

39

Remarques sur la proc�dure

1. Attendre au moins 30 minutes pour laisser les r�actifs, les �chantillons, les calibrateurs et les contr�les atteindre la temp�rature ambiante (20 � 26 �C) avant de les utiliser.

2. Passer les �chantillons, les calibrateurs et les contr�les au vortex pour bien les m�langer. �viter la formation de mousse.

3. Retirer le cadre des bandes de puits et le nombre voulu de bandes de microtitrage enduites du sachet en pellicule d�aluminium apr�s avoir laiss� la plaque atteindre la temp�rature ambiante (20 � 26 �C). Mettre les bandes de puits non utilis�es dans le sachet en pellicule d�aluminium avec le produit d�shydratant, resceller et conserver entre 2 et 8 �C.

4. Utiliser un nouvel embout de pipette en polypropyl�ne pour chaque r�actif, calibrateur, contr�le ou �chantillon afin d��viter la contamination.

5. Le dosage de tous les calibrateurs, les contr�les et les �chantillons doit �tre r�p�t� deux fois.

6. Avant l�addition du conjugu� d�anticorps anti-MPO et du r�actif de substrat TMB, s�assurer qu�il n�y a pas de r�sidu de tampon de lavage dans les puits. Toute trace de tampon de lavage dans les puits peut causer des variations des r�sultats des tests.

7. Pour obtenir des mesures exactes, l�ajout d��chantillon, de calibrateurs et de contr�les doit se faire avec pr�cision. Pipetter avec soin en utilisant uniquement des appareils calibr�s.

8. Tous les composants des kits, � l�exception du concentr� de tampon de lavage, sont fournis pr�ts � l�emploi. Se reporter au protocole ci-dessous pour pr�parer la solution de tampon de lavage.

Pr�paration du tampon de lavage � 1X

Laisser le concentr� de tampon de lavage atteindre la temp�rature ambiante (20 � 26 �C) avant de l�utiliser. Pr�parer le tampon de lavage 1X en versant le flacon de concentr� de tampon de lavage � 25X fourni dans un r�cipient propre de 1 litre. Rincer le flacon avec de l�eau d�sionis�e de type 1 pour retirer le tampon r�siduel et dissoudre les cristaux. Ajouter l�eau de rin�age, diluer avec de l�eau d�sionis�e de type 1 pour obtenir un volume total de 1 litre et bien m�langer. Si le tampon de lavage � 1X est conserv� entre 2 et 8 �C, il est stable pendant 2 mois.

40

Pr�paration de la plaque

Incubation des �chantillons

3. Apr�s le dernier lavage, tapoter la plaque contre du papier absorbant pour retirer le tampon de lavage qui pourrait rester. Ne pas laisser les puits s�cher. Proc�der imm�diatement � l��tape suivante.

Incubation de l�anticorps conjugu�

4. Apr�s le dernier lavage, tapoter la plaque contre du papier absorbant pour retirer le tampon de lavage qui pourrait rester. Ne pas laisser les puits s�cher. Proc�der imm�diatement � l��tape suivante.

Incubation du substrat et d�veloppement de la couleur

Arr�t et lecture

2. Faire tourner doucement la plaque sur une surface plane pour m�langer. S�assurer que toute la couleur bleue est devenue jaune.

3. Lire la densit� optique � 450 nm � l�aide d�un lecteur de microplaque. Il est recommand� d�effectuer une correction d�arri�re-plan � 630 nm.

41

1. Tracer une courbe d��talonnage � l�aide d�un logiciel appropri�. Une courbe � quatre param�tres est recommand�e. Les calculs manuels peuvent �tre effectu�s en reportant l�absorbance moyenne obtenue pour chaque calibrateur sur l�axe des y pour chaque concentration de MPO (pmol/l) sur l�axe des x.

2. En utilisant la valeur d�absorbance moyenne pour chaque �chantillon et contr�le, d�terminer la concentration correspondante de MPO en pmol/l � l�aide de la courbe d��talonnage. Le taux de MPO attribu� � chaque calibrateur refl�te l�utilisation du volume d��chantillon de 10 μl (une dilution de 1/10 dans la plaque), de sorte qu�il est inutile de faire d�autres calculs.

3. Les �chantillons dont les taux de MPO d�passent la valeur maximale des calibrateurs peuvent �tre rapport�s comme �tant sup�rieurs � ce taux de calibrateur, par exemple > 8 000 pmol/l. Il n�est pas recommand� de diluer davantage les �chantillons.

42

Les r�sultats d�une courbe d��talonnage typique utilisant les relev�s de densit�s optiques � 450 nm avec une correction � 630 nm sont indiqu�s sur l�axe des y par rapport � des concentrations de MPO (pmol/l) sur l�axe des x. L�utilisateur doit d�terminer une nouvelle courbe d��talonnage pour chaque test r�alis�. La courbe d��talonnage suivante est donn�e uniquement � titre d�exemple.

A

8 020

2,630

B

3 650

2,000

C

1 580

1,108

D

490

0,346

E

0

43

Protocole

Interpr�tation clinique

Le taux m�dian de MPO des sujets de la base de donn�es ajust�e �tait de 340 pmol/l et la plage des r�sultats �tait comprise entre 137 et 984 pmol/l. La distribution non param�trique des taux de my�loperoxydase dans cette population normale donne un intervalle de r�f�rence de 95 % central bilat�ral, corrig� pour tenir compte de l�influence du rejet des aberrations, compris entre 156 et 734 pmol/l. Cependant, dans cette application, l�intervalle de r�f�rence de 95 % inf�rieur bilat�ral plus appropri�, corrig� de nouveau pour tenir compte de l�influence du rejet des aberrations, est < 640 pmol/l.

44

Sensibilit�

La limite de d�tection minimale, calcul�e par l�interpolation de la moyenne plus deux �carts-types de 26 r�plicats du calibrateur (E) MPO � 0 pmol/l, est de 14 pmol/l MPO.

Pr�cision du dosage

La pr�cision totale et la pr�cision entre chaque dosage ont �t� d�termin�es en testant 6 �chantillons tests de plasma avec h�parine de lithium contenant des concentrations de MPO couvrant toute la plage d��talonnage du dosage, selon la directive EP5-A du CLSI (anciennement NCCLS). Ces �chantillons ont �t� dos�s en double, en utilisant un seul lot de r�actifs et de calibrateurs, sur deux plaques s�par�es par jour, pendant 20 jours. Une nouvelle courbe d��talonnage a �t� ex�cut�e en double sur chaque plaque. Les r�sultats de l��tude de pr�cision sont r�sum�s au tableau suivant.

�chantillon de plasma avec h�parine de lithium 1

307

80

10,2%

5,8%

�chantillon de plasma avec h�parine de lithium 2

610

80

5,8%

5,0%

�chantillon de plasma avec h�parine de lithium 3

1 285

76*

7,4%

5,7%

�chantillon de plasma avec h�parine de lithium 4

1 459

80

8,9%

8,6%

�chantillon de plasma avec h�parine de lithium 5

2 745

80

9,0%

9,0%

�chantillon de plasma avec h�parine de lithium 6

4 758

80

8,7%

6,4%

Moyenne

8,3%

6,7%

*Les donn�es de 1 jour ont �t� exclues de l�analyse � cause de r�sultats tr�s aberrants

45

Lin�arit�

R�cup�ration apr�s ajout

Neuf �chantillons de plasma trait�s � l�h�parine de lithium ont �t� additionn�s de 497, 1 456 et 2 851 pmol/l de MPO et analys�s pour �valuer la r�cup�ration. Le pourcentage de r�cup�ration a �t� calcul� en divisant la concentration moyenne de MPO mesur�e dans l��chantillon additionn� de MPO par la concentration pr�vue de MPO; la concentration pr�vue de MPO correspond � la somme de la concentration de MPO mesur�e dans l��chantillon contenant seulement du plasma et de la concentration de MPO dans l��chantillon additionn� de MPO. La r�cup�ration moyenne de MPO additionn�e dans le plasma avec h�parine de lithium �tait comprise entre 87 % et 117 %, la moyenne �tant de 100,7 %.

R�cup�ration par dilution

Neuf �chantillons de plasma avec h�parine de lithium ont �t� additionn�s de 2 851 pmol/l de MPO et dilu�s � 1:2, 1:4 et 1:8 avec du tampon de dosage. Le pourcentage de r�cup�ration a �t� calcul� en divisant la concentration moyenne de MPO dans l��chantillon pr�dilu�, multipli� par le facteur de dilution, par la concentration moyenne de MPO dans l��chantillon non pr�dilu�. La r�cup�ration moyenne d�une dilution de 1:2 �tait de 113 % pour le plasma avec h�parine de lithium, les taux de r�cup�rations �tant compris entre 107 % et 117 %.

46

R�activit� crois�e

Les r�actifs pouvant faire l�objet de r�action crois�e cit�s au tableau suivant ont �t� test� dans du plasma trait� � l�h�parine de lithium, conform�ment � la directive EP7-A du CLSI (anciennement NCCLIS). Toutes les prot�ines �tudi�es, ajout�es � un regroupement de plasma trait� � l�h�parine de lithium, ont pr�sent� une r�activit� crois�e inf�rieure � 0,007 % lors que la concentration du test �tait �lev�, et inf�rieure � 1,7 % lorsque la concentration du test �tait faible.

Substance test�e

Concentrations test�es (nmol/l)

1 250; 125; 12,5

Prot�ine C-r�active humaine

543; 54,3; 5,43

Lysozyme humain

4 464; 446,4; 44,64

IgA humaine

417; 41,7; 4,17

�lastase humaine

2 500; 250; 25

Peroxydase �osinophile humaine

887; 88,7; 8,87

Lactoperoxydase bovine

801; 80,1; 8,01

Lactoferrine humaine

781; 78,1; 7,81

COX1 ovin

893; 89,3; 8,93

COX2 humain

868; 86,8; 8,68

Peroxydase thyro�de humaine

595; 59,5; 5,95

Troponine I humaine

2 155; 215,5; 21,55

47

Substances interf�rentes

Les substances figurant dans le tableau suivant, qui ont �t� test�es dans du plasma contenant 3 000 pmol/l et 1 000 pmol/l de MPO selon la directive EP7-A du CLSI (anciennement NCCLS), n��taient pas interf�rentes, et ce, jusqu�aux concentrations indiqu�es. Une erreur syst�matique de 10 % ou moins n��tait pas consid�r�e comme interf�rente.

Acide ac�tylsalicylique

600

Dose toxique

Albumine

50 000

Taux lev�*

Amoxicilline

75

3 � dose th�rapeutique

Bilirubine conjugu�e

50

Taux lev�*

Bilirubine non conjugu�e

150

Taux lev�*

Captopril

5

Dose toxique

C�ruloplamine

600

Taux lev�*

Cholest�rol

1 000

Taux lev�*

ADN

16,7

Taux lev�*

F�nofibrate

45

3 � dose th�rapeutique

H�moglobine

5 000

H�molyse*

H�parine, lithium

3 000 U/L

3 � dose th�rapeutique

Hydrochlorothiazide

6

3 � dose th�rapeutique

Hydrocortisone

0,69

Dose toxique

Ibuprof�ne

500

Dose toxique

Indom�thacine

36

2 � dose th�rapeutique

Dinitrate d�isosorbide

0,15

3 � dose th�rapeutique

Lovastatine

53

2 � dose th�rapeutique

M�thotrexate

160

Dose th�rapeutique

M�toprolol

5

Dose toxique

Naprox�ne

500

4 � dose th�rapeutique

Niacine

0,5

5 � dose th�rapeutique

Nif�dipine

0,4

2 � dose th�rapeutique

Acide salicylique

600

Dose toxique

Azide de sodium

0,50 %

5 � dose de conservation

Triglyc�rides

5 000

Lip�mie

* Taux �lev� de substance interf�rente selon la directive EP7-A du CLSI (anciennement NCCLS)

Effet de crochet

48

Anticorps interf�rents

Des mod�les de r�gression logistiques � plusieurs variables (version SAS 8.0, SAS Institute) ont �t� �tablis pour calculer les risques relatifs approch�s et les intervalles de confiance � 95 %. Les covariables ajust�es comprenaient l��ge, le sexe, l�appartenance ethnique, le taux de troponine T (≤ 0,03 ng/ml vs > 0,03 ng/ml)7, le taux de prot�ine C-r�active (< 1 mg/l, 1-3 mg/l, > 3 mg/l)2, le taux de CK-MB (≤ 8,8 ng/ml vs > 8,8 ng/ml)7, les ant�c�dents de tabagisme, les ant�c�dents de diab�te, les ant�c�dents d�hypertension et les ant�c�dents d�hypercholest�rol�mie. Des informations au sujet de covariables manquantes sur certains sujets ont r�duit la population de l��tude. Le risque d��CIM chez tous les patients pendant la p�riode suivante de 30 jours a augment� proportionnellement aux quartiles des taux de my�loperoxydase.

Une analyse semblable portant sur des patients pr�sentant des taux constamment n�gatifs de troponine T (≤ 0,03 ng/ml) a r�v�l� �galement un risque significativement plus �lev� d��CIM chez les patients dont les taux plasmatiques de MPO se situaient dans les quartiles plus �lev�s. Les risques relatifs approch�s ajust�s et le pourcentage de patients s�par�s par un quartile de MPO, pr�sentant ou pas des �CIM � 30 jours sont indiqu�s aux graphiques et tableaux suivants.

49

1,0

2,5

2,8

3,3

S/O

1,3-4,8

1,5-5,6

1,7- 6,4

p = 0,007

p = 0,0021

p < 0,001

*Dans chaque analyse, le premier quartile a servi de groupe de r�f�rence

1,0

3,4

4,1

6,9

S/O

1,2-9,4

1,5-11,4

2,5-19,2

p = 0,0194

p = 0,007

p < 0,001

*Dans chaque analyse, le premier quartile a servi de groupe de r�f�rence

Notons qu�il conviendrait d�avoir diff�rentes valeurs seuils en fonction de chaque

population clinique.

100

90

80

70

60

ECIM

50

Non ECIM

40

30

20

0

10

<1 151

1 151-1 879

1 880-2 953

>2 953

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ECIM

Non ECIM

<1 151

1 151-1 879

1 880-2 953

>2 953

50

-1146.

-874.

, PA.

2. Brennan ML

5. CLSI (anciennement NCCLS). Document H18-A2 1999 NCCLS Wayne

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epr�sentant autoris� :

Molenstraat 15 2513 BH, La Haye

Pays-Bas

51

MC

CardioMPO

Kit de r�actifs pour dosage

immunoenzymatique

1. Attendre au moins 30 minutes pour que les r�actifs, les calibrateurs, les

contr�les et les �chantillons de patient aient atteint la temp�rature ambiante

(20 � 26 �C) avant de les utiliser.

2. Passer les calibrateurs, les contr�les et les �chantillons au vortex pour bien

les m�langer.

microtitrage appropri�s.

4. Pipetter 90 μl de tampon de dosage dans tous les puits de microtitrage

d��chantillon et de contr�le.

puits de microtitrage appropri�s.

6. Sceller et incuber pendant 45 minutes, en faisant tourner � 500 tr/min.

7. Laver 4 fois avec 400 μl de tampon de lavage et tapoter contre du papier

absorbant pour retirer l�exc�s de tampon.

8. Ajouter 100 μl de conjugu� d�anticorps anti-MPO (jaune) dans chaque puits.

9. Sceller et incuber pendant 45 minutes, en faisant tourner � 500 tr/min.

10. Laver 4 fois avec 400 μl de tampon de lavage et tapoter contre du papier

absorbant pour retirer l�exc�s de tampon.

11. Ajouter 100 μl de r�actif de substrat TMB dans chaque puits.

12. Incuber pendant 15 minutes, en faisant tourner � 500 tr/min.

13. Ajouter 100 μl de solution d�arr�t � chaque puits et tourner pour m�langer.

14. Lire l�absorbance � 450 nm, pr�f�rablement avec une correction � 630 nm.

Les calibrateurs et les contr�les peuvent devoir �tre positionn�s diff�remment

selon le nombre d��chantillons dos�s.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A CAL A 2 6 9 13 17 20 24 28 CTL3 35 39

B CAL B 3 7 10 14 18 21 25 29 CTL3 36 40

C CAL C 3 CTL1 10 14 18 21 25 29 32 36 40

D CAL D 4 CTL1 11 15 19 22 26 30 33 37 CAL A

E CAL E 4 7 11 15 19 22 26 30 33 37 CAL B

F 1 5 8 12 16 20 23 27 31 34 38 CAL C

G 1 5 8 12 16 CTL2 23 27 31 34 38 CAL D

H 2 6 9 13 17 CTL2 24 28 32 35 39 CAL E

52

Enzym-Immunoassay Reagenzien-Kit

quantitativen

er

klini

Patie en, bei denen das Risiko eines schweren

Reva nd Tod, besteht.

ung

von n Arbeiten l�sst sich schlie�en, dass das

arth gt ist und zur Plaquevulnerabilit�t

w�h yndrom entnommen wurden,

gnisses

wendigkeit

Sandwichmetho zur tim g MPO nzentratio H np D

um eine effizien Ve ng d H hab zu �h ste

Bestimmung von Myeloperoxidase in Humanplasma, das in Kombination mit dschen Vorgeschichte, EKG und kardialen Biomarkern herangezogen wird, um nten mit Thoraxschmerz auszuwert

kardiovaskul�ren Ereignisses, einschlie�lich Myokardinfarkt, Notwendigkeit einer skularisierung u

Die Aktivierung von Leukozyten stimuliert die Sekretion von MPO und die Bild Oxidantien1. Aus verschiedene

Enzym Myeloperoxidase (MPO), das von den Leukozyten sezerniert wird, an der erosklerotischen Progression beteili2.3

beitr�gt. MPO wurde mit der Entwicklung folgender Ereignisse assoziiert:

Entwicklung fettreicher weicher Plaque, Aktivierung von Protease-Kaskaden, diedie Stabilit�t und Thrombogenizit�t von Plaques beeintr�chtigen, Bildung toxischer und prothrombogener oxidierter Li

zytopide und Verbrauch von Stickoxid, was zur Vasokonstriktion f�hrt3.

Die MPO-Konzentration in Plasmaproben von Patienten, die im Notdienst rend der Untersuchung auf akutes Koronars

gibt Auskunft �ber das Risiko eines schweren kardiovaskul�ren Erei

(major adverse cardiac events, MACE), wie z.B. Myokardinfarkt, Not

einer Revaskularisierung oder Tod, f�r den Zeitraum der n�chsten 30 Tage und 6 Monate2. Das Risikoverh�ltnis (Odds-Ratio) f�r MACE steigt in allen Quartilen

der Population mit steigenden MPO-Plasmaspiegeln an. Die Vorhersagekraft der

MPO-Konzentration ist unabh�ngig von Alter, Geschlecht, Rasse, CPR-Stufe,

Troponin-T-Spiegel, CK-MB-Spiegel, anamnestisch Diabetes, Raucher, Hyperlipid�mie und Hypertonie.

er

R

enz

Kit

eine

zym

uno

say

est4

ch der

de

Bes

mun

der

-Ko

n in

uma

lasma.auch

er

ntroPO

Kit und der Reage

Kit sind zum Gebber

relief

it d

zien

it be

mt

rde

para

te

rpacku

un

and

ung

gew

rlei

jeweilig

gebrauc

zien-Kit. Die tats�chlichen Konzentrationsbereiche

ligen Kontrollen zu entnehmen. Kontrollen werden in

erden dann mit Waschpuffer gewaschen

isierten Antik�rper gebunden

sind, zu entfernen.

uf der

amethylbenzidin (TMB) zugegeben

llen

t enth�lt 5 KalibratoreKit. Die tats�chliche K

en Kalibratoretiketten zu entnehmen. Kalibratoren werden hsfertig geliefert.

D

der gleichen Weise wie Patientenproben verarbeitet. Kalibratoren werden den entsprechenden Kavit�ten in der Mikrotiterplatte direkt zugef�gt. Zu allen Kavit�ten, die zur Analyse der Kontrollen und Proben bestimmt sind, wird Assaypuffer gegeben. Aliquoten der Kontrollen oder Proben werden in die entsprechenden Kavit�ten gegeben und die Platte wird 45 Minuten bei 20-26 �C inkubiert. Die Kavit�ten w

um Antigene, die nicht spezifisch an den immobil

Nun wird in jede Vertiefung ein Anti-MPO monoklonaler Antik�rper, der mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) markiert ist, gegeben und 45 Minuten bei 20-26 �C inkubiert. Dieser konjugierte Antik�rper bindet an die MPO, die aPlatte eingefangen ist und die MPO in der Probe wird sandwichartig zwischendem Antik�rper in der Festphase und dem Antik�perkonjugat gebunden. Die Platte wird erneut mit Waschpuffer gewaschen, um ungebundenen HRP-markierten Antik�per zu entfernen. Nun wird jeder Vertiefung das Substrat, Tetr

und f�r 15 Minuten bei 20-26 �C inkubiert, wobei sich eine blaue Farbe entwickelt. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe einer Stop-L�sung angehalten und die Farbe schl�gt nach gelb um. Die enzymatische Umsetzung des Substrats wird spektrophotometrisch bei 450 nm, vorzugsweise mit Korrektur bei 630 nm, bestimmt und ist der MPO-Konzentration direkt proportional. Mit Hilfe der Absorptionen der Kalibratoren wird durch Auftragen der Absorptionen gegen die MPO-Konzentration eine Kalibrationskurve erstellt, mit der sich die MPO-Konzentrationen in den Kontrooder Proben ermitteln lassen.

nd Wasserstoffperoxid.

Detergenzien. und Stabilisatoren. Die

n f�r Volumen zwischen 10 μl und 1000 μl

tes Wasser

�

�

bei 630 nm

MPO-Konzentration aus der optischen Dichte der Kalibratoren berechnet

werden kann (optional).

Absorbierende Papiert�cher Mikroplattenwaschger�t

55

�

�

nz enth�lt 3,3�,5,5�-Tetramethylbenzidin (TMB).

er sp�len.

ofort mit reichlich Wasser sp�len und sofort

rt mit Seife und Wasser sp�len. Bei Exposition der

ich Wasser sp�len und sofort �rztliche Hilfe aufsuchen.

Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht verwenden.

�

ontrollen mitf�hren. Falls die Werte der Kontrollen nicht

i

Ung

Verf

werd i

m auf dem Etikett

ge ung,

eit aufweisen, nicht benutzen.

t lr�hrchen mit Hilfe von aseptischen

kopfdrehen gr�ndlich mischen. Lithiumauf

2-8 �C gebracht werden und bis

fbewahrt werden. Plasma muss unter

e p

20-2 nnen die Assays innerhalb von 8 Stunden nicht

rt werden.

Alle Plasmaproben m�ssen wie potentiell infekti�ses Material behandelt werden.

�

Es muss eine sachgem��e Handhabung und Entsorgung gem�� den �rtlichen, staatlichen und Bundesvorschriften erfolgen.

Bei Hautkontakt den betroffenen Bereich sofort mit Seife und WassBei Exposition der Augen s

�rztliche Hilfe aufsuchen.

Die Stop-L�sung enth�lt 0,4 N Schwefels�ure. Bei H

betroffenen Bereich sofo

Augen sofort mit reichl

�

LZIEN e�ffnete Test-Kits m�ssen nach Erhalt gek�hlt bei (2-8 �C) bis zum allsdatum gelagert werden. Nicht gebrauchte Mikrotiter-Kavit�ten-Streifen en mit Trockenmittel versiegelt im Folienbeutel bei 2-8 �C gelagert. Be

Lagerung gem�� Anleitung bleiben unge�ffnete Test-Kits bis zuangebenen Verfallsdatum stabil. Reagenzien, die Anzeichen einer Verf�rb

Tr�bung, eines Niederschlags oder einer Undichtigk

Bluproben sollten in Lithium-Heparin-Samme

Venenpunktionsmethoden entnommen werden. Um akkurate Ergebnisse zu

gew�hrleisten, Proben durch �ber

Heparin-Proben m�ssen sofort auf Eis oderzur Auftrennung bei 2-8 �C au

Zuhilfenahme einer Standardabtrennmethode, vorzugsweise in einer gek�hlten rifuge, von d

Richtlinien5 wird eine maximale Zeitdauer von 2 Stunden nach Entnahme mfohlen. Plasma darf nach der Abtrennung nicht l�nger als 8 Stunden bei 6 �C aufbewahrt werden. K�

abgeschlossen werden, muss das Plasma gek�hlt (2 bis 8 �C) gelage

56

abgetrennte Plasma

asma eingefroren bei -15�C oder

nicht wiederholt eingefroren und

Verf

Assays nach 8 Tagen nicht abgeschlossen oder muss das l�nger als 8 Tage aufbewahrt werden, ist das Pl

darunter zu lagern. Plasmaproben d�rfen

Plasmaspiegel sind nachweislich �ber 2 Einfrier-/Auftauzyklen stabil.

TESTVERFAHREN ahrenshinweise

1. eagenzien, Proben, Kalibratoren und Kontrollen vor Gebrauch f�r indestens 30 Minuten auf Raumtemperatur (20�26 �C) bringen. roben, Kalibratoren und Kontrollen durch Vortexen gr�ndlich vermischen.ng vermeiden. Rm

2. P

Schaumbildu

W

S

MS

l zur�cklegen,

w

F e

P en.

Alle Kalibratore

g

6. V enz

it�ten

n Waschpuffers k�nnen zu

isse f�hren.

folgendem Verfahren hergestellt.

1X Zubereitung des Gebrauchswaschpuffers

3. enn die Platte Raumtemperatur (20�26 �C) erreicht hat, den Kavit�ten-treifenrahmen entfernen und die ben�tigte Anzahl beschichteter ikrotiterstreifen aus dem Folienbeutel entnehmen. Nicht benutzte Kavit�ten-

treifen in den Folienbeutel mit darin enthaltenem Trockenmitte

ieder versiegeln und bei 2-8 �C aufbewahren.

4.�r jedes Reagenz, jeden Kalibrator, jede Kontrolle oder Probe eine neuolypropylen-Pipettenspitze verwenden, um Kontaminierung zu vermeid

5. n, Kontrollen und Proben sollten als Doppelbestimmung emessen werden. or dem Zusatz von Anti-MPO-Antik�rperkonjugat und TMB-Substratreagdarauf achten, dass sich keine Reste von Waschpuffer mehr in den Kav

befinden. Kleinste Mengen noch anwesendeVer�nderungen der Testergebn

7. Um genaue Messungen zu erzielen, muss die Zugabe der Proben, Kalibratoren und Kontrollen sehr pr�zise erfolgen. Vorsichtig und nur mit kalibrierten Ger�ten pipettieren. 8. Alle Kit-Komponenten, au�er dem Waschpufferkonzentrat, werden gebrauchsfertig geliefert. Die L�sung des Gebrauchswaschpuffers wird nach fferreste zu

teten

sind.

3. 10 μl gut gemisch

Kavit�ten pipettieren.

Probeninkubation Platte mit dem mitgelieferten Plattenversiegler versiegeln und auf e 1. inem

l

g

3.

bklopfen. Die Kavit�ten

Ant

nicht austrocknen lassen. Sofort mit dem n�chsten Schritt fortfahren. ik�rperkonjugat-Inkubation

3. 0 μl

ch dem letzten Waschvorgang

4. n

apiert�chern abklopfen. Die Kavit�ten

.

Sub

die Kavit�ten aspirieren. Zur Enfernung jeglicher Reste von Waschpuffer die Platte nach dem letzteWaschschritt auf absorbierenden P

nicht austrocknen lassen. Sofort mit dem n�chsten Schritt fortfahrenstratinkubation und Farbentwicklung

2. Auf einem Plattensch�ttler bei 500 U/min (rpm) bei Raumtemperatur (20-26 �C) inkubieren. Anhalten und Ablesen

Eine Hintergrundkorrektur bei 630 nm wird empfohlen.

58

g mit vier Parametern empfohlen.

pmol/l aus der Kalibrationskurve

PO-Konzentration, die jedem Kalibrator zugewiesen ist,

in

3. rationen, die �ber dem h�chsten Kalibratorwert

e

1. Mit Hilfe der entsprechenden Computer Software eine Kalibrationskurve erstellen. Es wird eine Kurvenanpassun

Manuelle Berechnungen k�nnen durch Auftragen der f�r jeden Kalibrator erhaltenen mittleren Absorption auf der y-Achse gegen die MPO-Konzentration (pmol/l) auf der x-Achse vorgenommen werden.

2. Mit Hilfe des mittleren Absorptionswertes f�r jede Probe und Kontrolle wird die entsprechende MPO-Konzentration in

ermittelt. Die M

entspricht dem Gebrauch einer Probenmenge von 10 μl (1:10 Verd�nnungder Platte), so dass keine weiteren Berechnungen notwendig sind. Proben mit MPO-Konzent

er

ionskurve

Zweck der

Die Ergebnisse einer typischen Kalibrationskurve zeigen die abgelesenenO.D.-Werte bei 450nm mit Korrektur bei 630 nm auf der y-Achse, aufgetragen gegen die MPO-Konzentrationen (pmol/l) auf der x-Achse. DBenutzer sollte f�r jeden durchgef�hrten Test eine neue Kalibraterstellen. Die folgende Kalibrationskurve dient ausschlie�lich dem

B 3650 2,000 C 1580 1,108 D 490 0,346

E 0 0,031

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

60

Verf

ahren Verl�ssliche und reproduzierbare Ergebnisse sind nur durch sorgf�ltige Einhaltung der in dieser Packungsbeilage beschriebenen Vorgehensweisen und Befolgung der Sicherheitsbestimmungen Ihres Labors gew�hrleist. Dabei sind die Wasch

�

f�hrt zu schlechter Pr�zision und falsch erh�hten o

Absorptionsme

einer Interf z durch hetero ntik�rper wie hum i-

Mausantik� (HAMA), deren Anwesenheit in Proben z erh�hten

oder falsch erniedrigten Werten f�hren k�nnte.

f�hren.

der erniedrigten

sswerten.

rantik�rper

eht auch hier die M�glichke

eren

phile A

ane Ant

rper

u falsch

tore

Verfah

dem

falsche

parametrische Verteilung der Myeloperoxidase-Konzentrationen in dieser

normalen Population ergibt nach der Eliminierung von Ausrei�ern ein zweiseitiges

zentrales 95% Referenzintervall von 156 � 734 pmol/l. Das bei dieser Applikation

eher angebrachte einseitige untere Referenzinterval ist jedoch ebenso nach

Eliminierung der Ausrei�er < 640 pmol/l.

61

keit

Empfindlich

ei

Stan )

bere

Die untere Nachweisgrenze, die durch Interpolation des Mittelwertes plus zwdardabweichungen von 26 Wiederholungen des 0 pmol/l MPO-Kalibrators (Echnet wurde, ist 14 pmol/l MPO.

Assay-Pr�zision ion wurden bestimmt, indem 6 Lithium- Die Gesamt- sowie die Intra-Assay-Pr�zis

Heparin-Plasmatestproben mit �ber den gesamten Kalibrationsbereich des Assays

unte i

sepa jede Platte wurde eine

L

L

Lithium-Heparin-

* Die 1 Tag entsprechende Menge an Daten wurde wegen groben Ausrei�ern von der Analyse ausgeschlossen.

62

Linearit�t

Lithium-Heparin-Plasmaproben, die durch Versetzen mit MPO auf hohe MPOationen

in den Mischungen wurde mit

estimmung der Linearit�t gem�� den Empfehlungen in

-Richtlinie EP6-A ausgewertet. Die Linearit�t des

Konzentrationen gebracht wurden, wurden mit unverd�nnten Plasmaproben niedriger MPO-Konzentration vermischt, um 9 MPO-Konzentrationen zu erhalten, die sich �ber den erwarteten linearen Bereich erstrecken und dar�ber hinaus gehen. Die Linearit�t der MPO-Konzentr

Hilfe der polynomialen Bder CLSI (ehemals NCCLS)

ng

PO-Konzentration der

ver

erw in

er unverd�nnten Plasmaprobe und der Konzentration des MPO-Zusatzes

entsprach. Die durchschnittliche Wiederfindung ten M iu

rt

von 100,7 %.

Wiederfindung nach Verd�nnu

setzten Probe durch die erwartete MPO-Konzentration errechnet, wobei die artete MPO-Konzentration der Summe der gemessenen MPO-Konzentration

d

zugesetzbis 117 % mit einem

POs in Lith Mittelwe

m-

Heparin-Plasma lag im B

ereich von 87 %

ng Ne n-Plasma n wurden mit 2851 pmol/l M setz

ans aypuffer 1:2, 1:4 und 1:8 verd�nnt. Die prozentuale

W e durch D der mit dem Verd�nnungs

multiplizierten mittleren MPO-Konzentration der vo ten Pro h die

mi tration d e ohne Vorverd�nnung errechnet. Die

mittlere Wiederfindung einer 1 nnung war bei Lithium-Heparin-

Pla , wobei derfindungsw im Berei 107

117

un Lithium-Heparichlie�end mit Ass

probe

PO ver

t und

iederfindung wurd

ivision

faktor be durc

rverd�nn

ttlere MPO-Konzen

er Prob:2 Verd�

smaproben 113 % % lagen.

die Wie

erte

ch von

Humanplasmaprobe verbundene Matrixeffekte ber�cksichtigt werden. PrognostiX empfiehlt keine weitere Probenverd�nnung. Proben mit MPO-Konzentrationenoberhalb des Wertes f�r den h�chsten Kalibrator sollten als gr��er als dieser Wert angegeben werden, z.B. > 8000 pmol/l. Eine 1:2 Verd�nnung unter Verwendung von Polypropylen-Laborutensilien kann erfolgen, wenn dem Laboranten bekannt ist, dass die aus dieser Messung erhaltene MPO-Konzentration ~13 % h�her als der tats�chliche Wert sein wird. Kreuzreaktivit�t Die in der nachfolgenden Tabelle aufgef�hrten potentiellen Kreuzreaktanten wurden den Vorschriften der CLSI (ehemals NCCLS)-Richtlinie EP7-A

ma und Assaypuffer getestet. Alle

entsprechend in Lithium-Heparin-Plas

gepr�ften Eiwei�e zeigten nach Zugabe zu einem Lithium-Heparin-Plasmapool bei hoher Testkonzentration eine Kreuzreaktivit�t von weniger als 0,007 % und bei niedriger Testkonzentration eine Kreuzreaktivit�t von weniger als 1,7 %. Testsubstanz Testkonzentrationen (nmol/l) Humanes alpha-1-Antitrypsin 1250 125 12,5 humanes C-reaktives Protein 543 54,3 5,43 Humanes Lysozym 4464 446,4 44,64 Humanes IgA 417 41,7 4,17 Humane Elastase 2500 250 25

Humane Eosinophil-Peroxidase 887 88,7 8,87

Lactoperoxidase, Rind 801 80,1 8,01

zu

%

Acetylsalicys�ure 600 Toxische Dosis

Albumin 50000 Hoch

Amoxicillin 75 3 x therapeuische Dosis

Bilirubin, konjugiert 50 Hoch Bilirubin, nicht konjugiert 150 Hoch Captopril 5 Toxische Dosis Ceruloplasmin 600 Hoch

Cholesterin 1000 ch*

HoDNA 16,7 Hoch

Fenofibrat

45 che Dosis

3 x therapeuisH�moglobin 5000 H�molyse*

Heparin-Lithium

3000 U/l ische Dosis

3 x therapeu

Hydrochlorthiazid 6 ische Dosis

3 x therapeuHydrocortison 0,69 Toxische Dosis

Ibuprofen 500 Toxische Dosis

Indomethacin

36 peutische

sis

2 x theraDo

Isosorbiddinitrat 0,15 ische Dosis

3 x therapeu

Lovastatin 53 eutische

s

2 x thera

pDosi

Methotrexat 160 Therapeutische Dosis

Metoprolol 5 Toxische Dosis

Naproxen 500 4x therapeutische Dosis

Niacin 0,5 5x therapeutische Dosis

Nifedipin 0,4 2 x therapeutische

Dosis

Salicyls�ure 600 Toxische Dosis

Natriumazid 0,50% 5x Erhaltungsdosis

Triglyzeride 5000 Lip�mie

Hook-Effekt

Bis zu einer Konzentration von 1 μmol/l MPO, die ungef�hr 100 mal h�her ist als

das obere Ende des bestimmbaren Wertebereichs und 600mal h�her als die

Test kein Hook-Effekt nachgewiesen werden.

65

St�rende Antik�rper

pdie

gen. Folglich konnte keine

signifikante Interferenz aufgrun RF festgestellt werden;

scheinb rationen wese

p-ANCA-Antik�rpern verringert sein.

A schweren ka skul�ren Ereignisse en die

Konzentrationen an 0 gelagerten us einer Studie mit

P erhalb von 24 Stunden n uftritt von Tho n

N pruch nahmen, analysier eilnehmer wurden e

f onate hinweg auf das Auftr ines Myokardinfarkt

Notwendigkeit einer Revaskularisierung (K rarterienb

p narintervention oder Kath rung mit �

Stenose in mindestens zwei gro�en Herzkranzgef��en) od

P n 23 bis 96 Jahren m m mittlere

k estellung erfolgte wie zu schrieben.7 Da

schwerer kardiovaskul�rer Ereignisse wurde durch Nachsorgeanrufe, die nach

3 Monaten erfolgten, bewer

Z r Risikoverh�ltnisse (O s) und

V tervalle wurden multivariante tische Regres

Version 8.0, SAS Institute) entwickelt. Die angepassten Kovarianten waren Alter,

Geschlecht, Rasse, Troponin T (≤0,03 ng/ . >0,03 ng/

Protein (<1 mg/l, 1-3 mg/l, >3 mg/l)2, CK-M (≤8,8 ng/m vs.

anamnestisch Raucher, Diabetes, Hyperto d hoher C

Fehlen kovarianter Information �ber einige enten f�hr

S ion. Das MACE-Risiko nahm allen Patiente

nachfolgenden 30-t�gigen Zeitperiode mit steigenden Quartilen der

Myeloperoxidasekonzentrationen zu.

Eine �hnliche Analyse von Patienten, die stets Troponin T-ne

ng/ml), zeigte bei Patienten mit MPO-Plas zentrationen in de

uartilen ebenfalls ein signifikant erh�htes MACE-Risiko. Angepasste

und Tabellen dargestellt.

d von HAMA oder k�nnen jedoch bei An

are MPO-Konzent

nheit von anti-MPO

gnostiX

bsch�tzung des Risikos vonMPO in 56

rdiova

n wurd

Plasmaproben a

atienten, die innns

ach A2

raxschmerzen de

otdienst in Aen 6 M

t.Die T

�ber di

olgend

eten eoa

s, der

ron

ypassoperation, ber 70-prozentiger

erkutane Koro

eterisie

er einehin

s Todesfalls

Tena

st a

Proben stammten von n Al

atienten im Altelinische Dignos

it einevor be

ter von 64. Die s Auftreten

a

0 Tagen und 6

tet.

ur Berechnung de

dds-Ratio

der 95 %

ertrauensin

logis

sionsmodelle (SAS

ml vs

ml)7, C-reaktives

B

>8,8 ng/ml)7,

nie un

holesterinwert. Das

Pati

te zur Reduktion der

tudienpopulat

bei

n in der

gativ 0,03

waren (≤n oberen

makon

Q

Risikoverh�ltnisse (Odds-Ratios) und der Prozentsatz von Patienten innerhalb eines MPO-Quartils mit und ohne MACE nach 30 Tagen sind in den folgenden

Abbildungen

66

95% KI kA 1,3-4,8 1,5-5,6 1,7- 6,4

0

p-Wert p = 0,0194 p = 0,007 p < 0,001

*Bei jeder Analyse diente das erste Quartil als Referenzgruppe

hingewiesen, dass die Cut-off-Punkte bei verschiedenen klinischen

pulationen unterschiedlich sein k�nnen.

Es wird darauf

Po

0-

2953

>2953

67

1. Klebanoff SJ, et al. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brennan ML, et al. N Engl J Med 2003; 349: 1595-604.

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7. McErlean, ES, et al. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

-874.

GARANTIE Es wird garantiert, dass die Leistung dieses Produkts der auf dem Etikett und der

in Prognostix, Inc.-Litera

tur f�r dieses Produkt beschriebenen Leistung

entspricht, wenn die cht n auch

ver�ffentli

en Anweisunge

bzgl. des Gebr

s dieses

Produkts streng eingeh werden. P stix, Inc. � mt keine w

alten

rogno

bernim

eitere

Garantie, ausdr�ckliche NT JEG

r oder stillschweigender Natur,

und LEH

LICHE

UNTERSTELLTE MARKTG NGIGKEI OD KE

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TSGARANTIE

ER TAUGLICH

IT F�R

EINEN BESTIMMTEN ZWECK AB. PROGNOSTIX, INC HAFTET UNTER KEINEN

UMST�NDEN F�R IRGENWELCHE INDIREKTEN, SPEZIELLEN ODER

FOLGESCH

�DEN WELCHER ART AUCH IMMER. Hergestellt f�r:

PrognostiX, Inc.

e Avenue, Cleveland, Ohio 44106

Tel: (866) 358-9828, (216) 445-7469 (PG

Fax: (216) 444-5335

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www.prognostix.com

ertre

Emergo Europa

2513 BH, Den Haag

l: + 5

e Marke der PrognostiX, Inc.

10265 Carnegi

NX)

Autorisie

rter V

ter:

Niederlande

Te

31 (0)70 345 8

70

Fax: +31 (0)70 346 7299

68

Enzym-Immunoassay Reagenzien-Kit

vor Gebrauch

gen.

ischen.

rechenden

- und Kontrollen

pipettieren.

n.

pipettieren.

12. 15 Minuten lang bei 500 U/min (rpm) rotierend inkubieren.

13. Jeder Kavit�t 100 μl Stop-L�sung z gen und durch vorsichtiges

Schwenken vermischen.

14. se mit Korrektur bei 630 nm, ablesen.

Gegebenenfalls is eine andere

Anordnung der Kalibratoren un .

1 2 3 4 9 10 11 12

1. Alle Reagenzien, Kalibratoren, Kontrollen und Patientenproben f�r mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur (20�26�C) brin

2. Kalibratoren, Kontrollen und Proben durch Vortexen gr�ndlich durchm

Mikrotiterkavit�ten pipettieren. 4. 90 μl Assaypuffer in alle Mikrotiterkavit�ten f�r Proben

f�

t, je nach Anzahl der zu analysierenden Proben,

d Kontrollen zu w�hlen

5 6 7 8 A KAL A 2 6 9 13 17 20 24 28 KTL3 35 39

B KAL B

18 21 3 7 10

14 25 29 KTL3 36 40

C KAL C 3

KT

L1 10 14

18 21

25 29 32 36 40

D KAL D 4

KT

L1 11 15

19 22 26 30 33 37 KAL A

E KAL E 4 7 11

15 19 22 26 30 33 37 KAL B

F 1 5 8 12

16 20 23 27 31 34 38 KAL C

G 1 5 8 12 16 KTL2 23 27 31 34 38 KAL D

H 2 6 9 13 17 KTL2 24 28 32 35 39 KAL E

69

it

rischio

v

t

,

con aterosclerotica.2,3 L�enzima MPO � stato

,

ci e

prot nitrico, determinando vasocostrizione.3

ienti, durante il

una

e eventi

avversi cardiaci maggiori (MACE), cio� infarto miocardico, necessit� di

e dei livelli

o,

per la misurazione

della concentrazione di MPO nel plasma uma

vengono forniti separatamente per facilitare il confezionamento e la

su iche di o fi i c at ca or o iti p i al

utilizzato per la determinazione quantitativa della mieloperossidasi nel plasma umano. Va utilizzato unitamente all�anamnesi, all�ECG e ai biomarcatori cardiaci

nella valutazione di pazienti che presentano dolore toracico e che sono a enti avversi cardiaci maggiori, ch

di ee includono l�infarto miocardico, la necessit� di rivascolarizzazione o il decesso.

BREVE DESCRIZIONE E SPIEGAZIONE tivazione dei leucociti stimola la se

L'acrezione di MPO e la produzione di ossidanti.1 Numerose evidenze suggeriscono che l'enzima mieloperossidasi (MPO)

secreto dai leucociti, partecipi alla progressione del processo aterosclerotico e tribuisca alla vulnerabilit� della placca

collegato allo sviluppo della placca soffice con prevalente componente lipidica

all'attivazione dei sistemi a cascata delle proteasi che influiscono sulla stabilit� e

sulla trombogenicit� della placca, sulla produzione di lipidi ossidati citotossirombogenici e sul consumo di ossido

La concentrazione plasmatica di MPO in campioni ottenuti da p

azperiodo in cui sono stati tenuti in osservazione al Pronto Soccorso

per sindrome coronaria acuta, ha consentito di predire il rischio di sviluppar

rivascolarizzazione o morte, nel periodo di tempo che va dai 30 giorni fino ai 6

mesi successivi.2L� odds ratio per MACE aumenta con l�aumentarplasmatici di MPO in tutti i quartili della popolazione. Il valore predittivo della

concentrazione di MPO � indipendente da et�, sesso, razza, livello di PCR, livello di troponina T, livello di CK-MB e da un�anamnesi positiva per diabete, tabagismiperlipidemia o ipertensione.

Il kit di reagenti

Ca

� u

aggio

enzim

tico

4

no. I kit di controllo e di calibr

azione

�

von

esser

utiliz

i insi

e al

di re

genti

O�, ma

manipolazione.

ardio

-E) d

utilizz

e con

PO�

I val

effet

rela

i al c

librat

sono

dica

ll�et

tta

gni

ala d

alibr

ore. I

librat

i son

forn

ront

l�uso.

70

ss

calibratori vengono aggiunti direttamente al pozzetto appropriato della

pone del test viene aggiunto a tutti i pozzetti che si intende

isi dei campioni o dei controlli. Si aggiunge un'aliquota di

di

cato

di incubare per 45 minuti a

all�MPO trattenuto sulla piastra, e

l'MPO contenuto nel campione viene ad essere �sandwiched� tra l�anticorpo

ente

del colore dal blu al giallo.

banza dei

o monoclonale murino specifico verso

colore giallo contenente un anticorpo monoclonale murino

contiene 3 controlli (1-ttivi intervalli di conc

ono indicati sull�etichetta di ogni fiala di controllo. I controlli sono trattati allo tesso modo dei campioni ottenuti da pazienti.

I

micropiastra. Il tamutilizzare per l�anal

campione o di controllo al pozzetto appropriato e si lascia incubare la piastra per 45 minuti a 20-26� C. Successivamente, i pozzetti vengono lavati con tamponelavaggio per rimuovere gli antigeni che non si sono legati in maniera specifica all�anticorpo immobilizzato. Ad ogni pozzetto viene aggiunto un anticorpo monoclonale anti-MPO marcon l�enzima HRP (perossidasi) e si lascia quin

20-26� C. Questo anticorpo coniugato si lega

presente nella fase solida e l�anticorpo coniugato. La piastra viene nuovamlavata con il tampone di lavaggio per rimuovere l�anticorpo marcato con HRP che non si � legato. Il substrato, rappresentato dal cromogeno tetrametilbenzidina (TMB), viene quindi aggiunto ad ogni pozzetto e lasciato incubare per 15 minuti a 20-26� C. Al termine dell�incubazione si svilupper� un colore blu. La reazione colorimetrica viene arrestata con l�aggiunta della soluzione bloccante che provoca il viraggio

71

1) o distillata

capace di leggere a 450 nm, preferibilmente con

correzione at 630 nm

re le curve appropriate per calcolare la

o).

�

�

ere trattati come materiale

�

n accordo alle normative locali, statali e federali.

concentrazione di MPO dalla densit� ottica dei calibratori (facoltativ

Carta millimetrata per la rappresentazione grafica manuale di dati (facoltativa).

Solo per uso professionale.

potenzialmente infettivo. Devono essere osservate le procedure per la corretta manipolazione e

eliminazione, i

72

la zona con

te un medico.

na con acqua e sapone. Se viene a contatto

la zona con abbondanti getti d�acqua e

o.

n

I kit non ancora aperti devono essere conservati in frigorifero (2-8� C) al

ra

non siccante

ati come indicato, i kit non ancora

ull'etichetta. Non

e presentano segni di scolorimento, torbidit�, precipitati o

ontenenti litio-eparina

risul nti litio-eparina devono essere immediatamente posti

sepa

fuga

massimo di due ore dal momento del prelievo.5 Una volta separato, il plasma

i� di 8 ore. Se il saggio non potr� essere

C). � stato

� nel plasma si mantengono stabili per 8

r viene completato entro 8 giorni o se il plasma

plasma

non te congelati e scongelati, dal momento che

scon

Se viene a contatto con la pelle, sciacquare subito la zona con acqua e sapone. Se viene a contatto con gli occhi, sciacquare subito

abbondanti getti d�acqua e consultare immediatamen

Soluzione bloccante contenente acido solforico 0,4N. Se viene

la pelle, sciacquare subito la zo

con gli occhi, sciacquare subito

consultare immediatamente un medic

momento del ricevimento e fino alla data di scadenza. Le strisce per micropiastutilizzate devono essere sigillate in un sacchetto di alluminio con es

e conservate a 2-8� C. Se vengono conservdi scadenza indicata s

aperti rimarranno stabili fino alla data utilizzare i reagenti ch

perdite.

I campioni ematici devono essere raccolti in provette c

utilizzando una tecnica sterile di prelievo venoso. I campioni devono essere mescolati accuratamente mediante inversione per garantire la precisione dei tati. I campioni contene

in ghiaccio oppure a 2-8� C e conservati a 2-8� C fino al momento della razione. Il plasma deve essere separato dalle cellule utilizzando una

procedura standard di separazione, mediante preferibilmente una centrirefrigerata. Le linee guida CLSI (precedentemente NCCLS) raccomandano un

deve rimanere a 20-26� C per non p

gioni a 2-8� C. Se il saggio non

gi� separato deve essere conservato per oltre 8 giorni, quest�ultimo deve essere congelato ad una temperatura pari o inferiore ai -15� C. I campioni di devono essere ripetutamen

PROCEDURA DEL SAGGIO Procedurali Note

rima dell�uso, portare i reagenti, i campioni i calibratori e i controlli a 1. P

t

2. Tm

3. Rimuovere dal sacchetto di alluminio la cornice di supporto delle strisce e il

n to la piastra a

t i striscia inutilizzata nel

sacchetto di alluminio contenente l�e

2

4. Utilizzare un n vo puntale in polipropilene per ogni reagente, calibratore,

5. ato.

6. gente

ozzetti non vi siano residui di tampone di

rniti in forma pronta all�uso. Per preparare la diluizione del tampone di

emperatura ambiente (20-26� C) per almeno 30 minuti. utti i campioni, i calibratori e i controlli devono essere accuratamente escolati mediante vortex. Evitare la formazione di schiuma.

umero richiesto di strisce rivestite dopo avere porta

emperatura ambiente (20-26� C). Riporre ognssiccante, risigillare e conservare a

-8� C. uo

controllo o campione per evitare contaminazioni. Tutti i calibratori, i controlli e i campioni devono essere analizzati in duplicPrima dell'aggiunta dell�anticorpo coniugato anti-MPO e del rea

substrato TMB, assicurarsi che nei plavaggio. La presenza di residui del tampone di lavaggio pu� causare

variazioni nei risultati del saggio. 7. Per garantire l�accuratezza della misurazione, i campioni, i calibratori e i controlli devono essere aggiunti in modo preciso. Pipettare con attenzione utilizzando soltanto dispositivi calibrati. 8. Tutti i componenti del kit, ad eccezione del tampone di lavaggio concentrato, sono fo

lavaggio seguire la seguente procedura.

Tampone di lavaggio diluito 1X Prima dell�uso, portare a temperatura ambiente (20-26� C ) il tampone di lavaggio concentrato. Preparare una diluizione 1X del tampone di lavaggio versando l'intero contenuto della bottiglia di tampone concentrato 25X in un cilindro pulito da un litro. Risciacquare accuratamente la bottiglia con acqdeionizzata tipo I per rimuovere il tampone residuo e per dissolvere i cristAggiungere il liquido proveniente dal risciacquo, diluire con acqua deionizzatatipo I, portando al volume finale di un litro e mescolare accuratamente. Se conservato a 2-8� C, il tampone di lavaggio diluito 1X � stabile fino a due mesiPreparazione della piastra

ua

alli.

.

iato

74

Incubazione dei campioni

1. Sigillare la piastra con il sigillatore di piastra fornito e incubare su un

re

Incubazione con l�anticorpo coniugato

3. Dopo l�ultimo lavaggio, asciugare la piastra capovolgendola su tovaglioli di carta per eliminare tutto il tampone di lavaggio dai pozzetti. Non lasciaseccare i pozzetti. Procedere immediatamente alla fase successiva.

2. e incubare su un

3.

o

pozzetti.

i

ente alla fase successiva.

4. Dopo l�ultimo lavaggio, asciugare la piastra capovolgendola su tovaglioli dcarta per eliminare tutto il tampone di lavaggio dai pozzetti. Non lasciare seccare i pozzetti. Procedere immediatam

6� C).

2. Incubare su un agitatore per piastre impostato a 500 rpm ptemperatura ambiente (20-2

un

lo.

raccomanda di eseguire la correzione per il fondo a 630 nm.

1. zando il software appropriato. Si

to alla

CALCOLO DEI RISULTATI Costruire una curva di calibrazione utiliz

raccomanda di utilizzare un �curve fit� a quattro parametri. Il calcolo manuale pu� essere eseguito riportando in grafico il valore medio di assorbanza ottenuto per ciascun calibratore sull�asse delle ordinate (y) rispet

2. Utilizzando il valore medio di assorbanza di ogni campione e controllo,

anto, non sono necessari altri calcoli.

ello,

dei campioni.

tture

30 nm, sono mostrati sull�asse delle

ordinate rispetto alle co te sull�asse delle

d

determinare la corrispondente concentrazione di MPO in pmol/l dalla curva di calibrazione. Il livello di MPO assegnato a ciascun calibratore � stabilito in rapporto all�uso di un volume di 10 μl di campione (a una diluizione di 1:10 nella piastra), pert

3. I campioni che presentano livelli di MPO superiori al valore del calibratore a pi� alta concentrazione, possono essere riportati come superiori a quel livcio� > 8000 pmol/l. Non si consiglia un�ulteriore diluizione

ESEMPIO DI CURVA DI CALIBRAZIONE I risultati di una tipica curva di calibrazione ottenuta utilizzando le le

O.D. a 450 nm, con correzione a 6

ncentrazioni di MPO (pmol/L) mostraascisse. L�utilizzatore dovrebbe costruire una nuova curva di calibrazione a

ogni saggio. La seguente curva di calibrazione � fornita solo a scopo illustrativo.

Calibratore Livello di MPO (pmol/l) (O.D. a 450 nm, correzione a 630 nm) A 8020 2,630

B 3650 2,000 C 1580 1,108 D 490 0,346

E 0 0,031

00 8000 9000

2.5

2

1

00.5010002000300040005000600070

3

76

LIMITI cedura Pro

Si potranno ottenere risultati affidabili e riproducibili quando si esegue procedura del saggio dopo avere pienamente compreso le istr

uzioni

rbanza falsamente alti o

�

Interpreta

contenute nell�inserto della confezione e in conformit� con le norme di buona pratica di laboratorio. Le procedure di lavaggio sono critiche. Un lavaggio insufficiente determi

una scarsa precisione nelle letture e valori di assobassi.

Come con un qualunque altro sistema di analisi che impieghi anticorpi di origine animale, esiste la possibilit� di interferenza da anticorpi eterofili, come gli anticorpi umani anti-immunoglobuline murine (HAMA), presenti nel campione, che nella lettura potrebbe causare valori falsamente alti o bassi. Altri fattori, t

ati erronei.

altri esami diagnostici.

rischio identificati per la malattia coronarica quali ECG, si, marcatori

di necrosi miocardica, ecc.

oggetti di sesso maschile (n = 150) e femminile (n = 150), in una popolazione

di donatori apparentemente sana. � stato utilizzato uno schema per la rilevazione

dei valori aberranti e la trasformazione di Box-Cox, seguita da un metodo solido

di rilevazione dei dati aberranti, allo scopo di eliminare sette valori aberranti.6

Dal

momento che non vi era alcuna differenza significativa dei livelli di MPO in

rapporto al sesso, l�intervallo di riferimento � stato stimato considerando l�intera

popolazione, dopo avere effettuato la correzione per i valori aberranti.

I valori mediani di concentrazione di MPO dei soggetti in banca dati dopo

correzione era di 340 pmol/l e l�intervallo dei risultati era compreso tra 137 e

984 pmol/l. La distribuzione non parametrica dei livelli di mieloperossidasi in

questa popolazione normale ha prodotto un intervallo di riferimento al 95%

centrale a due code, corretto per evitare l�influenza dell�eliminazione dei valori

aberranti, pari a 156 � 734 pmol/l. Tuttavia, in questa applicazione, il limite

inferiore pi� appropriato dell�intervallo di riferimento al 95% a una coda, ancora

una volta corretto per eliminare l�influenza dell�eliminazione dei valori aberranti ,

� < 640 pmol/l.

i reperti

a

altri clas

anamne

Con il saggio s

77

Sensibilit�

Il limite minimo di rilevazione, calcolato interpolando la media pi� due deviaziodard di 26 replicati del calibratore di MPO (E), 0 pmol/l, � pari a 14 pm. ni

stan ol/l di

MPO

Precisione del saggio

Larecisione generale e intra-seduta � stata determinata testando 6 campioni io-eparina contenenti concentrazioni di MPO

p

test di plasma trattato con lit

distribuite lungo l�intera gamma di calibrazione del saggio, secondo le linee guida

ti

in d

pias

in d

EP5-A della CLSI (precedentemente NCCLS). Questi campioni sono stati saggiauplicato, utilizzando un unico lotto di reagenti e calibratori, in due diverse tre al giorno, per 20 giorni. Ȓ stata eseguita una nuova curva di calibrazione uplicato per ogni piastra. I risultati di questi studi di precisione sono riassunti

eparina Campione 1 P

epa

eparina Campione 3

Plasma con litio

Linearit�

Ai campioni di plasma con litio-eparina a cui erano stati aggiunti (�spiked�)

i nelle miscele, utilizzando la valutazione polinomiale di linearit�

e guida EP6-A della CLSI (precedentemente NCCLS). Il

ato lineare nei campioni di plasma con litio-eparina

elevati livelli di MPO, sono stati mescolati con campioni puliti di plasma con bassi livelli di MPO per creare 9 concentrazioni di MPO che rientravano o superavano l�intervallo lineare atteso. � stata determinata la linearit� dei valori di MPO misurat

alle concentrazioni di MPO comprese tra 14 pmol/l e 9410 pmol/l, entro 60 pmol/l o al 6% di questo intervallo. Recupero nei campioni �spiked� Nove campioni di plasma con litio-eparina sono stati �spiked� con 497, 1456, e 2851 pmol/l di MPO ed � stato analizzato il loro recupero. Il recupero percentuale � stato calcolato dividendo la concentrazione media di MPO misurata nel campione �spiked" per la concentrazione attesa di MPO, dove la concentrazione

attesa M ne

m

l� u

Recupero nei campioni diluiti

PO era la somma della concentrazione di MPO misurata nel campio MPO aggiunto al campione. Il recupero

pulito di plasma e la concentrazione dim

edio di MPO nei ca87% e il 117% con

pioni di plasma con litio-na media del 100,7%

eparina spiked era compreso tra .

Nove campioni di plasma con litio-eparina sono stati �spiked� con 2851 pmol/l di

te diluit :4 e 1:8 con il tampone del test. Il recupero

lcolato dividendo la concentrazione media di MPO nel

moltipli r il fattore di diluizione, edia

O nel campione non sottoposto a pre-diluizione. Il recupero

e 1:2 e 13% per i c oni di on lit

ero percentuale compreso tra il 107% e il 117%.

m resenza d i un campio i plasm o. Pr

diluizio campioni. I campioni che presentano i

MPO superiori al valore del calibratore a pi� alta c no

er� conto del fatto la concentrazione di MPO ottenuta

on questo tipo di misurazione sar� superiore di circa il 13% rispetto al suo

MPO e successivamenpe ca

i 1:2, 1

rcentuale � statocampione pre-diluito, coP

cato pe

per la m

della

ncentrazione di Mmedio di una diluizionepup

ra del 1

ampi

plasma c

io-

atrice legati alla psconsiglia un�ulteriore

i 10 μl dne dei

ne d

a uman

ognostiX livelli d

oncentraz

ione posso

essere

riportati come superiori a quel livello, cio� > 8000 pmol/l. Tuttavia, � possibile utilizzare nel saggio una diluizione 1:2, utilizzando provette da laboratorio inpolipropilene, tenendo p

cvalore reale.

79

Reattivit� crociata

ella

ina

lle

ol/l)

I possibili agenti che possono determinare una reazione crociata, mostrati nseguente tabella, sono stati analizzati in plasma contenente litio-eparina secondo le linee guida EP7-A del CLSI (precedentemente NCCLS). Tutte le proteine analizzate, quando sono state aggiunte ai campioni di plasma con litio-eparraggruppati, hanno mostrato una cross-reattivit� inferiore allo 0,007% aconcentrazioni pi� alte e una cross-reattivit� inferiore al 1,7% alle pi� basse concentrazioni esaminate. Sostanze analizzate Concentrazioni analizzate (nm

Proteina C-reattiva, umana 543, 54,3, 5,43

Lisozima, umano 4464, 446,4, 44,64 IgA, umane 417, 41,7, 4,17 Elastasi, umana 2500, 250, 25 Perossidasi eosinofila, umana 887, 88,7, 8,87 Lattoperossidasi, bovina 801, 80,1, 8,01 Lattoferrina, umana 781, 78,1, 7,81 COX1, ovine 893, 89,3, 8,93 COX2, umane 868, 86,8, 8,68

Perossidasi tiroidea, umana 595, 59,5, 5,95

Troponina I, umana 2155, 215,5, 21,55

80

Sostanze che interferiscono con il saggio

o

Le sostanze mostrate nella seguente tabella, quando sono state analizzate in campioni di in plasma contenenti 3000 pmol/L e 1000 pmol/L di MPO secondo le linee guida EP7-A del CLSI (precedentemente NCCLS), hanno mostrato di non interferire con il saggio fino alle concentrazioni indicate. Una distorsione ugualeinferiore al 10% non � stata considerata come interferenza.

Acido acetilsalicilico 600 Dose

tossica

Albumina 50000

Alta*

Amoxicillina 75 dose

3 volte superiore alla.

terapeutica

Bilirubina, coniu

gata 50 Alta* Bilirubina, non-coniugata 150

Alta*

Captopril 5 Dose

tossica

Ceruloplasmina 600

Alta

Colesterolo 1000

Alta*

DNA 16,7

Alta Fenofibrato 45 la dose

.

3 volte superiore al

terapeutica

Emoglobina 5000

Emolisi*

Eparina, litio 3000 U/l dose

3 volte superiore allaterapeutica. Idroclorotiazide 6 3 volte superiore alla dose

terapeutica.

Idrocortisone 0,69 Dose tossica

Ibuprofene 500 Dose tossica

Indometacina 36 2 volte superiore alla dose

terapeutica.

Isosorbide dinitrato 0,15 3 volte superiore alla dose

terapeutica.

Lovastatina 53 2 volte superiore alla dose

terapeutica.

Metotrexato 160 Dose terapeutica

Metoprololo 5 Dose tossica

Naprossene 500 4 volte superiore alla dose

terapeutica.

Niacina 0,5 5 volte superiore alla dose

terapeutica.

Nifedipina 0,4 2 volte superiore alla dose

terapeutica.

Acido salicilico 600 Dose tossica

Azide sodica 0,50% 5 volte superiore alla dose

terapeutica.

Trigliceridi 5000 Lipemia

* Alta concentrazione di sostanza che interferisce con il saggio secondo EP7-A del

CLSI (precedentemente NCCLS)

81

Anticorpi che interferiscono con il saggio

i

eri che oscillavano

dal 37% al 43%. Quindi, non sono stat

un�in iva caus da RF; tutta apparenti

di MP idotti in pr anticorpi anti-MPO p-

Effetto gancio

TM. Il recupero medio di MPO da questi campioni era del 100% mentre i singoli recuperi oscillavano dal 96% al 109%. Dieci campioni, che si sapeva contenere gli anticorpi anti-MPO p-ANCA, hanno mostrato un recupero medio del 40% con singoli recup

e osservate evidenze in favore di ata da HAMA o esenza di

terferenza significatO possono essere r

via, i livelli ANCA.

f PO, circa 100 volte eriori rispetto al lim o

d e e 600 volte s iori rispetto al livello mediano

r nei pazienti dello studio clini

del rischio di eventi avversi cardiaci maggiori, sono stati misurati i livelli di MPO in

5 i di plasma provenienti d anca che conservava i campioni di

pazienti inclusi in uno studio. Tale s stato con

eran ronto Soccorso en ore dall�in

toracic ti per progressio

miocardico, per necessit� di un interv di rivascolarizzazi nto

chirurgico di bypass coronarico, intervento coronarico percu

cateterizzazione, in presenza di stenos periore al 70

coronarici principali) o decesso nei 6 mesi cessivi. I campioni analizzati c

s erano stati otten pazienti da t�

mediana di 64 anni. La diagnosi clinica tata stabilita

precedentemente descritto.7 L�incidenza venti cardiaci avversi maggiori �

stata valutata mediante interviste tele he di follow-up

Sono stati sviluppati modelli di regressione logistica m 8.0,

SAS Institute) per calcolare odds ratio e intervalli di confidenza al 95%. Le

covariate corrette erano et�, sesso, ra troponina T

>0,03 ng/ml)7, proteina C-reattiva (<1 mg/l, 1-3 mg/l, >3 m

(≤ 7, abitudine al fumo, anamne

per ipertensione, per ipercolesterolem a mancanza di in ulle

c lcuni soggetto ha deter la riduzion

popolazione dello studio. Il rischio di MACE in tutti i pazienti, nel successivo

periodo di 30 giorni, aumentava con l�aumentare dei quartili dei livelli di

Anche un�analisi simile in pazienti che erano costantemente negativi per

troponina T (≤0,03 ng/ml) ha evidenziato un rischio significativamente pi� alto di

MACE nei pazienti con livelli plasmatici di MPO nei quartili pi� alti. Gli odds ratio

corretti e le percentuali relative ai pazienti che rientravano in un quartile con e

senza MACE dopo 30 giorni sono mostrati nei grafici e nelle tabelle che seguono.

tto gancio a concentraziitsim

ino a 1 μmol/l di M

sup

e mas

ell�intervallo accettabil

uper

egistrato

co.

Card

60 campion

a una b

tudio era

dotto su pazienti che si nza del dol

o presentati al Po.

tro 24

sorgeore ne verso l�infarto

2 I partecipanti sono stati monitora

ento

one (interve

taneo o

i su

% in almeno due vasi

sucuti da

on il i 23 ai 96 anni, con un'e

� s di e

secondo quanto

fonic

a 30 giorni e a 6 mesi.

ultivariati (SAS versione

zza ,

(≤0,03 ng/ml vs. g/l)2, CK-M

B si positiva per diabete,

8,8 ng/ml vs. >8,8 ng/ml)

ia . L

formazioni s

ovariate di a

minato

e delle dimensioni della

0

1,0 3,4 4,1 6,9

IC 95% ND 1,2-9,4 1,5-11,4 2,5-19,2

Valore P p = 0,0194 p = 0,007 p < 0,001 *In ogni analisi il primo quartile costituiva il gruppo di riferimento Va notato che potrebbe essere opportuno utilizzare differenti punti di cut-off a seconda della diverse popolazioni cliniche.

83

1. Klebanoff SJ, et al. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brenna 595-604.

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10

06

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R

ppresenta

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ato:

Emergo Europa

2513 BH, The Hague i

Te

31 (0)70 345 8

0

Fax: +31 (0)70 346 7299

84

zimatico

zienti i calibratori e i

escolati

l pozzetto appropriato

della micropiastra.

4. Pipettare 90 μl di tampone de pozzetti per i campioni o per i

re su

9. Sigillare e lasciare incubare per 45 minuti, ruotando la piastra a 500 rpm.

10. Lavare 4 volte con 400 μl di tampon per lavaggio diluito e tamponare su

carta assorbente per rimuovere il tampone in eccesso.

11. Aggiungere 100 μl di reagente substrato TMB in ciascun pozzetto.

12. Incubare per 15 minuti, ruotando la piastra a 500 rpm.

13. Aggiungere 100 μl zion ascun pozzetto, e ruotare

delicatamente per mescolar

14. Leggere a 4

Potrebbe essere necessario po i controlli in modo

differente in base al numero d

1 2 3 8 9 10 11 12

Kit di reagenti per saggio immunoen

1. Prima dell�uso, portare i reagenti, i campioni dei pa

controlli a temperatura ambiente (20-26� C) per almeno 30 minuti.

2. Tutti i campioni, i calibratori e i controlli devono essere m

l test in tutti i

e

e bloccante a ci

di solu

e.

50 nm, preferibilmente con correzione a 630 nm

sizionare i calibratori e

i campioni analizzati.

4 7

5 6 A CAL A 2 6 9

13 17 20 24 28 CTL3 35 39

B CAL B 3 7 1

0 14 18 21 25 29 CTL3 36 40

C CAL C 3 CTL1 10

14 18 21 25 29 32 36 40

D CAL D 4 CTL1

11 15 19 22 26 30 33 37 CAL A

E CAL E 4 7

11 15 19 22 26 30 33 37 CAL B

F 1 5 8 12 16 20 23 27 31 34 38 CAL C

G 1 5 8 12 16

CTL2 23 27 31 34 38 CAL D

H 2 6 9 13 17 CTL2 24 28 32 35 39 CAL E

85

SYMBOLS KEY / CLAVE DE LOS E DES SYMBOLES /

Manufactured By / Fabricado por / Fabriqu� par / Hergestellt von /

Fabriqu� par / Prodotto da / Fabricado por

Authorized Representative / Representante autorizautoris� / Autorisierter Vertreter / Rappresentante

ado / Repr�sentant

autorizzato

In Vitro Diagnostic Medical Device / Producto sanitario para

ostic in

ivo

diagn�stico m�dico in vitroVitro / Appareil m�dical de diagnvitro / In-vitro diagnostisches medizinisches Ger�t / Dispositdiagnost

ico medicale per uso in vitro e / Code de lot / Chargenbezeichnung / Batch Code / C�digo de lot

Codice di lotto

Expiration Date in Year-Month-Day Format / Fecha de caducidad en

formato de a�o-mes-d�a / Date de p�remption en format An-Mois-Jour

cata come

/ Verfallsdatum im Format JJ-MM-TT / Data di scadenza indiAnno-Mese-Giorno peratura / Limite de

Temperature Limitation / L�mite de tem

temp�rature / Temperaturbegrenzung / Limiti di temperatura

CE Mark / Marca CE / Marque CE / CE-Zeichen / Marchio CE

Consult Instructions For Use / Consulte las instrucciones de usung beac

so / Voir

hten /

le mode d�emploi pour l�utilisation / GebrauchsanweiConsultare le Istruzioni per l�uso

Catalog Number / N�mero de cat�logo / Num�ro de catalogue /

Katalognummer / Numero di catalogo

Pro t Fr igh ot�j e / � e la lumi�re

Vo t �tz bew n eg da

tec

om L

t / Pr

ase d

la luz

Tenir

l�abri d

/

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Warning: Contain an rc er dve cia: ien

material de origen ti nt iel

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/ Avverte Con ma e di origine uman

s Hum

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sseme�lt M

nt : Coterialie

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origin

huma

g: En

Ursp

ngs

nze:

tiene

terial

a Cauti / Precauci e / Mise en garde : Irritant /

Vo t: nd zi Ir e

on: Irrirsich

tantReize

�n: Irrione:

tantritant

86

Enzyme Immunoassay / Inmunoan�lisis enzim�tico / Dosage immunoenzymatique / Enzym-Immunoassay / Saggio immunoenzimatico

Reagent / Reactivo / R�actif / Reagenz / Reagente

Kit / Equipo / Kit/ Kit / Kit

est

Anti-MPO Antibody Conjugate / Conjugado de anticuerpo anti-MPO Conjugu� d�anti

/

corps anti-MPO / Anti-MPO Antik�rperkonjugat /

Anticorpo coniugato anti-MPO

Stop Solution / Soluci�n de parada / Solution d�arr�t / Stop-L�sung / Soluzione bloccante

ent / Reactivo de sustrato TMB / R�actif de

substrat TMB / TMB-Substratreagenz / Reagente substrato TMB

oplaca

de titulaci�n, recubierta con anticuerpo anti-MPO, 96 pocillos /

Microplaque enduite d�anticorps anti-MPO, 96 puits / Mit Anti-MPOiastra

rivestita con anticorpi anti-MPO, 96 pozzetti

Microtiter plate coated with Anti-MPO Antibody, 96 wells / Micr

Antik�rper beschichtete Mikrotiterplatte, 96 Kavit�ten / Microp

Plate sealer / Sellador de placas / Feuille scellante pour plaque / Plattenversiegler / Sigillatore di piastra

ncentrado de soluci�n

)

25X

25X Wash Buffer Concentrate / Co

amortiguadora de lavado 25X / Concentr� de tampon de lavage (25 X/ 25X Waschpufferkonzentrat / Tampone di lavaggio concentrato Contents / Contenido / Contenu / Inhalt / Contenuto

Calibrator / Calibrador / Calibrateur / Kalibrator / Calibratore

Control / Control / Contr�le / Kontrolle / Controllo

Concentration / Concentraci�n / Concentration / Konzentration/ Concentrazione

13575 30043

3/06

88